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【研究背景】

在多發(fā)性硬化癥等脫髓鞘疾病中，慢性病變中的炎癥組織環(huán)境阻止了祖細胞的有效募集，導致少突膠質細胞再生和髓鞘再生失敗。雖然將高髓鞘形成性胎兒或誘導性多能干細胞來源的人類少突膠質細胞祖細胞 (hOPC) 進行移植是一種有效的方法，但供體細胞的低存活率和OPC命運維持率低是臨床治療的主要障礙?，F(xiàn)有的細胞注射方法由于剪切應力導致細胞膜損傷，移植后存活率僅為1%至32%，并加劇了局部炎癥，從而增加移植物失敗的可能性。剪切稀化水凝膠 (STH) 被認為是減少細胞死亡的有希望的候選材料。此類水凝膠在剪切應力下流動，并在應力消除后恢復，使其適合用于細胞注射。

針對上述問題，布法羅大學Stelios T. Andreadis的研究團隊開發(fā)了一種創(chuàng)新的注射性剪切稀化水凝膠（STHs）。這些水凝膠具有可調節(jié)的粘彈性和生物活性，通過最小侵入性注射，將hOPCs注射到先天性低髓鞘病的小鼠模型中。這種小鼠模型模擬了人類的先天性低髓鞘疾病，如Pelizaeus-Merzbacher病，已成為評估髓鞘化細胞制劑的金標準。研究結果表明，使用STHs顯著提高了移植后hOPCs的存活率，支持其分化為形成髓鞘的少突膠質細胞，并增加了小鼠大腦的髓鞘化程度，展示了STHs作為hOPCs輸送有效載體在治療髓鞘疾病中的潛力。相關研究在2024年7月12日以“Injectable shear-thinning hydrogels promote oligodendrocyte progenitor cell survival and remyelination in the central nervous system”為題發(fā)表于《Science Advances》（DOI: 10.1126/sciadv.adk9918）。

（1）超分子STH的合成與表征

水凝膠的構建單元包括透明質酸硫醇（HA-SH）、肝素硫醇（Hep-SH）、β-環(huán)糊精馬來酰亞胺（βCD-Mal）和8臂聚乙二醇金剛烷（PEG-Ad）。水凝膠的開發(fā)涉及兩個關鍵步驟。首先，通過8臂PEG-Ad與單功能化的βCD-Mal在1:1的化學計量比下形成宿主-客體復合物，工程化多臂馬來酰亞胺終止的超分子聚合物（SMP-Mal）。其次，在pH=7.4下，8臂SMP-Mal與HA-SH之間進行Michael加成反應，形成三維網(wǎng)絡（圖1）。為了固定生存信號（HBD-RGD5融合肽和血小板源性生長因子），Hep-SH與肝素結合雙域肽和/或血小板源性生長因子（PDGF-AA）預混，并在與SMP-Mal交聯(lián)前添加到HA-SH中。

圖1 STH設計的示意圖和水凝膠前體的¹H NMR表征

（2）水凝膠的剪切稀化和自我修復特性

STHs通過透明質酸硫醇（HA-SH）和肝素硫醇（Hep-SH）與SMP-Mal在pH=7.4下通過Michael加成反應形成。根據(jù)HA-SH和SMP-Mal的不同配比，制備了不同硬度的水凝膠（STH-1、STH-2和STH-3）。這些超分子水凝膠由于宿主-客體動態(tài)鍵的可逆性，表現(xiàn)出剪切稀化和自我修復特性，使其適合于治療物的注射。流變學測量顯示，STHs在高剪切率下表現(xiàn)出較低的粘度，說明主-客體鍵的解離和更流體化的行為。在低剪切率下，水凝膠迅速恢復初始粘度，顯示出自我修復特性。這種快速從固態(tài)到流體態(tài)的轉變對于成功注射和細胞保護至關重要，因為它使注射過程中水凝膠能夠耗散能量，并在注射后恢復儲存模量以穩(wěn)定注射部位的材料（圖2）。

圖2 STH的粘彈性和流變性質

（3）剪切應力下STHs顯著提高hOPCs的存活率

成功的細胞移植治療神經(jīng)退行性疾病的一個主要障礙是供體細胞在微創(chuàng)注射時的低存活率。研究發(fā)現(xiàn)，超過95%的神經(jīng)祖細胞（NPCs）在脊髓損傷（SCI）模型中移植后會死亡，這很可能是由于剪切應力對細胞膜的作用。在研究中，通過細拉玻璃針（內徑：100至200微米，相當于28至32G針頭）注射時，測量了在有或沒有STHs的情況下細胞死亡率。結果表明，在鹽溶液中注射時，鼠少突膠質前體細胞（CG-4細胞系）和人胎兒CD140a分選的少突膠質前體細胞（hOPCs）的細胞死亡率分別為29.47± 3.15%和25.13±3.23%，而在無剪切應力條件下分別僅為6.63±1.60%和6.57±0.71%。所有三種STH配方顯著降低了CG-4和hOPCs的細胞死亡率（圖3）。研究表明，STH-2在注射剪切應力下對細胞死亡的保護效果最好。

圖3 注射 STH 后 hOPC 存活率的體外評估

（4）生物信號的評價促進hOPCs的存活

研究團隊假設STHs中固定的生物信號可能進一步促進移植后hOPCs的存活和增殖。無論是前體細胞還是成熟的少突膠質細胞都高度表達αv/α6/α7和β1/β5/β8整合素，指導其存活、增殖和終末分化以髓鞘化神經(jīng)元軸突。通過RNA測序，研究團隊確定了hOPCs中各種整合素的表達。設計了一種創(chuàng)新的雙域肽，肝素結合域（HBD）–RGD5，促進細胞通過整合素α5β1、αvβ1或αvβ8結合。實驗結果顯示，HBD-RGD5顯著促進了hOPCs的粘附和擴展，相比對照組，細胞數(shù)量和增殖率顯著提高（圖4）。PDGF-AA通過血小板源性生長因子受體α促進hOPCs的存活和增殖。實驗結果表明，PDGF-AA以劑量依賴性方式顯著增加了hOPCs的增殖率。

圖4 hOPC 響應生物信號而增殖

（5）STH內hOPCs的存活、分化和遷移

研究團隊評估了hOPCs在3D水凝膠環(huán)境中的存活情況。所有三種水凝膠都支持hOPCs的存活（細胞死亡率：STH-1：7.10±1.03%，STH-2：5.97±2.19%，STH-3：5.58±0.97%）。盡管總體存活率相似，但三種水凝膠中細胞的分布不同。STH-1和STH-3中的細胞聚集，而STH-2中的細胞分布更加均勻。在3D水凝膠中，STH-2和低硬度的STH-3支持hOPCs的分化，而STH-1則不支持。研究表明，STH-2在注射剪切應力下對CG-4細胞和hOPCs提供了最高水平的保護，維持了更均勻的細胞分布，并支持少突膠質細胞的分化。為了研究移植后hOPCs的遷移，STH-2與不同濃度的HBD-RGD5結合，細胞通過水凝膠遷移，結果表明，HBD-RGD5固定的細胞遷移數(shù)量減少，表明細胞在3D水凝膠中的結合增加。

圖5 雙結構域融合肽HBD-RGD5上hOPC的分化

（6）體內移植中STH顯著提高hOPCs的存活率

為了評估體內移植后hOPCs的存活率，研究團隊使用了免疫缺陷的NSG小鼠。通過細拉玻璃針將hOPCs單側注射到2-3天齡的小鼠大腦中。每只小鼠接受0.5微升細胞（每微升100,000個細胞），分別使用HBSS、單獨的STH-2或含PDGF-AA和HBD-RGD5的STH-2進行注射。結果顯示，與對照組（HBSS）相比，嵌入水凝膠的細胞數(shù)量顯著增加（P < 0.0001）。PDGF-AA和HBD-RGD5的固定進一步增加了小鼠大腦中hNA+細胞的數(shù)量（圖6）。研究表明，注射后6周內觀察到注射的細胞在前后軸上擴散并遷移了近1500微米，表明遷移速度約為30微米/天。與對照組相比，注射STH-2與PDGF-AA和HBD-RGD5組的細胞存活率提高了52%（圖6）。

圖6 移植STH-2和固定化生物線索后，NSG小鼠腦中的hOPCs存活率提高

（7）通過STHs輸送hOPCs改善小鼠大腦的髓鞘化

研究團隊評估了通過STHs移植的hOPCs在shiverer/rag2小鼠（先天性低髓鞘疾病模型）中的髓鞘化潛力。將hOPCs（0.5 μL，100,000個細胞/μL）雙側注射到新生小鼠的大腦胼胝體中。12周后，腦切片的免疫染色顯示，與HBSS對照組相比，STH-2組的小鼠大腦中髓鞘形成顯著增強。注射含有PDGF-AA和HBD-RGD5的STH-2進一步增加了髓鞘形成區(qū)域，并顯著提高了移植的hOPCs的存活率（圖3）。

圖7 在輸送添加了生物信號的STH-2的hOPCs后，shiverer/rag2小鼠大腦的髓鞘形成增加

研究小結：

通過移植到先天性低髓鞘和銅質酮誘導的脫髓鞘小鼠大腦中，hOPCs傾向于遷移到白質通道中并沿其遷移，導致宿主軸突的強勁髓鞘化。這種遷移特性和髓鞘化潛力使hOPCs成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）脫髓鞘疾病的有前途的細胞治療候選者。然而，臨床轉化受到供體細胞低存活率和維持OPC命運的主要障礙的限制。之前的研究報告指出，注射到鹽水或細胞培養(yǎng)基中的細胞只有不到5%的存活率。在本研究中，研究人員假設在剪切應力作用下經(jīng)歷動態(tài)凝膠-溶膠轉變的STH可以在注射過程中保護hOPCs，并允許移植的hOPCs從注射部位有效遷移，以重新髓鞘化整個胼胝體。為此，該團隊設計了一種基于STH的細胞輸送系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以消散剪切應力，并作為固定生存生物信號的平臺，以增強注射后的細胞活力，并隨之增加髓鞘化程度。研究結果表明，STHs在促進細胞存活和髓鞘化方面表現(xiàn)出極大的潛力，有望成為治療多發(fā)性硬化癥等脫髓鞘疾病的新方法。

原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adk9918