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研究背景：

針對上述問題，北京大學(xué)第三醫(yī)院田華教授團(tuán)隊(duì)研究開發(fā)了一種新型磁控微藻基微型機(jī)器人（M-CH@QUE），用于精確治療前內(nèi)側(cè)骨關(guān)節(jié)炎（AMOA）。通過將Fe3O4沉積并結(jié)合槲皮素負(fù)載到小球藻，實(shí)現(xiàn)了藥物的高效負(fù)載和釋放。研究表明，M-CH@QUE不僅具有良好的生物相容性和磁響應(yīng)性能，還能有效減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)軟骨修復(fù)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其在AMOA小鼠模型中的優(yōu)異治療效果，表明M-CH@QUE是一種有前景的新型治療手段，為未來臨床應(yīng)用提供了有力支持。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)基于微藻的多功能治療平臺奠定了基礎(chǔ)，并展示了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用潛力。該文章于2025年3月4日以《Magnetically controlled chlorella-based microrobots loaded with quercetin for precision treatment of anteromedial osteoarthritis》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》上（DOI: 10.1002/adfm.202418197）。

（1）磁控微型機(jī)器人的特性研究

圖1A展示了M-CH@QUE的制備流程，包括固定、滲透和磁化過程。圖1B的TEM圖像顯示小球藻細(xì)胞內(nèi)部成功負(fù)載磁性顆粒且細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。圖1C的SEM圖像表明磁性顆粒在細(xì)胞內(nèi)均勻分布。圖1D的XRD分析確認(rèn)了Fe?O?晶體結(jié)構(gòu)的存在。圖1E的VSM磁滯回線顯示M-CH具有優(yōu)異的超順磁性。圖1F的共聚焦顯微鏡圖像證實(shí)磁性顆粒未掩蓋小球藻的熒光信號。圖1G證明M-CH在PBS中60天內(nèi)顯著降解，具有良好的生物降解性。這些結(jié)果表明M-CH@QUE作為新型多功能治療平臺，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有潛力。

圖1 磁控微型機(jī)器人的特性研究。（A）M-CH@QUE治療OA機(jī)制的圖形摘要：CH通過固定、磁化等工藝制成M-CH。槲皮素（QUE）負(fù)載后，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射給藥，其在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的分布由半圓形永磁體控制。M-CH@QUE到達(dá)關(guān)節(jié)腔后釋放QUE，被軟骨細(xì)胞吸收，促進(jìn)IGF-1R磷酸化，抑制NOX2和NOX4表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，保護(hù)軟骨細(xì)胞，抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)軟骨分化；（B）不同F(xiàn)e?O?濃度下M-CH的SEM圖像；（C）能量色散X射線分析顯示M-CH中存在碳（藍(lán)色像素）和鐵（綠色像素）；（D）M-CH的XRD分析；（E）M-CH的VSM測試；（F）小球藻的亮場和熒光圖像；（G）在PBS中觀察到M-CH的逐漸降解

（2）M-CH的細(xì)胞相容性和載藥量

圖2A顯示，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明M-CH在10?/mL濃度下與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)3天無顯著細(xì)胞毒性。圖2B、C的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了M-CH的低細(xì)胞毒性，并分析了不同條件下的軟骨細(xì)胞凋亡率。圖2D的Calcein-AM和PI染色熒光圖像展示了與不同材料共孵育3天后活細(xì)胞（綠色）和死細(xì)胞（紅色）的狀態(tài)。圖2E顯示，單獨(dú)用槲皮素處理軟骨細(xì)胞的CCK-8實(shí)驗(yàn)在第3天也未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。圖2F表明M-CH在不同初始濃度下具有良好的載藥效率。圖2G顯示M-CH在PBS中可實(shí)現(xiàn)槲皮素的持續(xù)釋放。圖2H的阿辛藍(lán)染色結(jié)果顯示，不同處理?xiàng)l件下軟骨細(xì)胞分泌的糖胺聚糖有積極變化趨勢。這些結(jié)果表明M-CH具有良好的生物相容性、可降解性、高效的藥物裝載及緩釋特性，為關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部給藥提供了新策略。

圖2 M-CH的細(xì)胞相容性和藥物負(fù)載能力。（A）用M-CH培養(yǎng)3天后的軟骨細(xì)胞的CCK-8測定結(jié)果；（B）軟骨細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果；（C）定量分析B中的凋亡率（數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n=8）；（D）軟骨細(xì)胞的熒光圖像（與各種材料共孵育3天后用鈣黃綠素-AM和PI染色，紅色代表死細(xì)胞，綠色代表活細(xì)胞）；（E）與QUE共孵育的軟骨細(xì)胞的CCK-8測定（第3天）；（F）M-CH在不同初始濃度下的載藥效率；（G）在PBS中，QUE從M-CH@QUE的累積釋放質(zhì)量隨時間變化；（H）不同條件下軟骨細(xì)胞的阿爾新藍(lán)染色結(jié)果（右上圖為肉眼圖像，大圖為光學(xué)顯微鏡圖像，n=3，IL-1β：10 ng/ml，QUE：16 μM，CH@QUE/M-CH@QUE：與CH@QUE或M-CH@QUE共培養(yǎng)，單因素方差分析后Tukey HSD檢驗(yàn)，NC：陰性對照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）

（3）QUE保護(hù)OA軟骨細(xì)胞作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

通過SwissTarget數(shù)據(jù)庫篩選出99個QUE潛在靶基因，并與GeneCards中篩選的OA相關(guān)基因進(jìn)行比對，最終找到50個共同基因（圖3A）?；赟TRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）顯示，胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）是第10個關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的基因（圖3B、C）。進(jìn)一步分析GSE55457數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因（DEGs），鑒定出672個DEGs，并通過火山圖展示其分布（圖3D）。通過Venn圖分析，發(fā)現(xiàn)QUE靶基因、OA相關(guān)基因和DEGs之間存在5個共有基因（圖3E）。ROC曲線評估表明，這5個共有基因具有作為生物標(biāo)志物的潛力（圖3F）。GO/KEGG富集分析顯示，QUE與氧化應(yīng)激相關(guān)性顯著，提示其可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)通路發(fā)揮治療作用（圖3G）。分子對接實(shí)驗(yàn)預(yù)測了QUE與IGF1R的結(jié)合模式及結(jié)合自由能（圖3I），并通過表面等離子共振（SPR）技術(shù)驗(yàn)證了兩者的結(jié)合能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示QUE與IGF1R結(jié)合后引起顯著的共振角度變化，計算得到的解離常數(shù)（KD）為1.68E-05 M，表明QUE對IGF1R具有較高的親和力（圖3J、K）。這些結(jié)果綜合表明，QUE可能通過調(diào)節(jié)IGF1R及其相關(guān)的氧化應(yīng)激通路來保護(hù)軟骨細(xì)胞，為治療骨關(guān)節(jié)炎（OA）提供了新的靶點(diǎn)和機(jī)制。

圖3 槲皮素在骨關(guān)節(jié)炎（OA）條件下保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測。（A）槲皮素（QUE）與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)的重疊靶點(diǎn)；（B）預(yù)測的抗骨關(guān)節(jié)炎QUE靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)；（C）基于PPI網(wǎng)絡(luò)中度的基因排名；（D）從GEO數(shù)據(jù)集（GSE55457）識別的差異表達(dá)基因（DEG）；（E）QUE、骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)和DEG的重疊靶點(diǎn)；（F）來自（E）的5個基因的受試者工作特征（ROC）曲線；（G）前10位基因本體（GO）富集分析結(jié)果，涵蓋生物過程、細(xì)胞組分和分子功能；（H）通過KEGG富集分析的前30個信號傳導(dǎo)途徑；（I）IGF1R和QUE的分子對接結(jié)果；（J）槲皮素與IGF1R的動力學(xué)測試曲線；（K）槲皮素與IGF1R的穩(wěn)態(tài)擬合曲線

（4）QUE作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

首先，通過IL-1β刺激原代軟骨細(xì)胞，成功建立了體外OA模型，該模型抑制了細(xì)胞增殖并促進(jìn)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（圖S4A-C）。此外，IL-1β刺激還導(dǎo)致活性氧（ROS）過度激活、NOX2和NOX4上調(diào)，同時抑制了IGF1R及其磷酸化形式P-IGF1R的表達(dá)（圖S4D-F）。添加QUE能夠顯著逆轉(zhuǎn)這些細(xì)胞損傷，但Western blot分析顯示，QUE并不能逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的IGF1R下調(diào)，這表明QUE可能不是直接上調(diào)IGF1R表達(dá)，而是通過促進(jìn)IGF1R磷酸化調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，從而保護(hù)軟骨細(xì)胞。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，使用了IGF1R磷酸化的特異性抑制劑NVP-AEW541。結(jié)果顯示，QUE顯著改善了由IL-1β抑制的軟骨細(xì)胞增殖，但這種效應(yīng)被IGF1R磷酸化抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖4A）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持了這些發(fā)現(xiàn)（圖4E）。此外，Annexin V/碘化丙啶雙染和流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在存在抑制劑的情況下，QUE的保護(hù)效果顯著減弱（圖4B），Western blot進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果（圖4D）。進(jìn)一步評估了QUE促進(jìn)軟骨形成的潛力。

圖4 槲皮素通過促進(jìn)IGF-1R磷酸化促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡。（A）在不同條件下軟骨細(xì)胞的存活率（通過CCK-8測定，n=3）；（B）流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)展示不同條件下軟骨細(xì)胞的凋亡率；（C）凋亡率的定量分析（n=3）；（D）Western blot分析處理后軟骨細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（軟骨細(xì)胞在無血清條件下培養(yǎng)2天，n=3）；（E）EdU測定法檢測用各種試劑處理24小時后增殖細(xì)胞的比例；（F，G）分別對（D）和（E）的結(jié)果進(jìn)行定量分析（n=3）。實(shí)驗(yàn)中，槲皮素（QUE）濃度為16 μM，IL-1β濃度為10 ng/mL，抑制劑濃度為10 μM。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析后Tukey HSD檢驗(yàn)，*p<0.001

阿辛藍(lán)染色顯示，抑制劑顯著降低了QUE在OA條件下增強(qiáng)軟骨形成的能力（圖5A）。Western blot結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)，表明QUE促進(jìn)了與軟骨形成相關(guān)的標(biāo)記物ACAN、COL2α和SOX9的表達(dá)，同時抑制了MMP13的表達(dá)，而抑制劑處理則逆轉(zhuǎn)了這些變化（圖5B）。此外，先前被QUE抑制的氧化應(yīng)激水平在加入抑制劑后再次升高，這證實(shí)了QUE是通過調(diào)節(jié)ROS水平、調(diào)節(jié)IGF1R磷酸化及抑制NOX2和NOX4表達(dá)來保護(hù)軟骨細(xì)胞的（圖5D, E）。

圖5 槲皮素作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。（A）不同實(shí)驗(yàn)條件下阿新藍(lán)染色結(jié)果的肉眼和光學(xué)顯微鏡圖像；（B）不同處理共培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中軟骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot結(jié)果；（C）（B）的統(tǒng)計結(jié)果（n=3）；（D）通過DCFH-DA測定法在不同條件下評估軟骨細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ROS水平；（E）軟骨細(xì)胞中ROS相關(guān)蛋白的Western blot結(jié)果；（F，G）（D）和（E）的定量結(jié)果（n=3）。實(shí)驗(yàn)中，槲皮素（QUE）濃度為16 μM，IL-1β濃度為10 ng/mL，抑制劑濃度為10 μM

（5）M-CH的磁致動特性

圖6A展示了磁驅(qū)動系統(tǒng)的示意圖，該系統(tǒng)由控制模塊、群操作模塊和視覺模塊組成。圖6B通過M-CH被矩形永久磁鐵吸引至Eppendorf管壁一側(cè)的現(xiàn)象，驗(yàn)證了其良好的磁場可控分布特性。在自制磁驅(qū)動系統(tǒng)中，圖6C顯示在4 Hz頻率的旋轉(zhuǎn)磁場作用下，分散的微機(jī)器人能夠快速準(zhǔn)確地聚集到系統(tǒng)幾何中心并形成穩(wěn)定群體。圖6D記錄了M-CH沿預(yù)設(shè)矩形路徑的移動情況，表明其運(yùn)動迅速且精確，具備穩(wěn)定的輸送能力。圖6E和F模擬了M-CH在體外軟骨中的定向移動，證明其能在受損軟骨區(qū)域迅速精準(zhǔn)地聚集，為OA疾病模型的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖6 M-CH的磁致動特性。（A）磁致動系統(tǒng)示意圖；（B）用永磁體磁化CH并證明其磁特性；（C）自行構(gòu)建的磁致動系統(tǒng)，用于通過旋轉(zhuǎn)磁場進(jìn)行遷移率測試（測試期間的聚集體圖像）；（D）移位照片；（E）軟骨中M-CH@QUE的體外遞送實(shí)驗(yàn)裝置；（F）M-CH@QUE在軟骨上的積累過程

（6）M-CH @QUE對AMOA的體內(nèi)治療作用

首先，通過手術(shù)切斷前交叉韌帶并移除內(nèi)側(cè)半月板建立了大鼠OA模型，術(shù)后兩周開始給予關(guān)節(jié)腔注射QUE、CH@QUE或M-CH@QUE，每四周一次，持續(xù)12周（圖7A）。為了促進(jìn)M-CH@QUE在膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)聚集，使用柔性半圓形磁鐵環(huán)繞于該組大鼠膝關(guān)節(jié)周圍（圖S7）。體外熒光成像顯示，M-CH@QUE在OA大鼠體內(nèi)能更有效地聚集，尤其是在永久磁鐵引導(dǎo)下（圖7B, C）。利用CatWalk系統(tǒng)評估右后肢功能恢復(fù)情況，定量分析接觸面積和接觸平均強(qiáng)度后發(fā)現(xiàn)，M-CH@QUE組在6周和12周治療后表現(xiàn)出顯著改善（圖7D-H）。

圖7 M-CH@QUE在體內(nèi)對骨關(guān)節(jié)炎（OA）的治療作用。（A）動物實(shí)驗(yàn)示意圖；（B）PBS和M-CH@QUE的體外熒光成像（激發(fā)波長：675 nm，發(fā)射波長：720 nm，熒光標(biāo)記：Cy5.5）；（C）在有或沒有永磁體的OA大鼠中M-CH@QUE的熒光成像；（D）使用CatWalk系統(tǒng)評估右后腿的結(jié)果；（E，F(xiàn)）來自（D）的6周時接觸面積和接觸平均強(qiáng)度的定量分析（n=3）；（G，H）來自（D）的12周時接觸面積和接觸平均強(qiáng)度的定量分析（n=3）。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析后Tukey HSD檢驗(yàn)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

術(shù)后12周，通過磁共振成像評估各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷情況。結(jié)果顯示，OA組顯示出股骨和脛骨關(guān)節(jié)軟骨嚴(yán)重磨損，并且某些區(qū)域擴(kuò)展至軟骨下骨；而QUE組雖有輕微改善，但在關(guān)節(jié)軟骨和骨髓腔中的信號增強(qiáng)表明仍然存在軟骨磨損和骨髓水腫問題（圖 8A）。相比之下，CH@QUE組進(jìn)一步改善了癥狀，而M-CH@QUE組表現(xiàn)出了最佳治療效果，其磁共振圖像未顯示明顯的異常信號。這些結(jié)果通過肉眼觀察膝關(guān)節(jié)及H&E染色得到了進(jìn)一步確認(rèn)（圖 8B, C）。

圖8（A）膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的MRI評估，紅色箭頭指示受損軟骨位置（n=6）；（B）各組12周時膝關(guān)節(jié)軟骨的代表性照片；（C）H&E染色評估軟骨變性和治療效果，黑色箭頭指示軟骨磨損區(qū)；（D）使用OARSI評分系統(tǒng)對軟骨損傷進(jìn)行量化（n=6，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）；（E）各組軟骨厚度的定量分析（n=6）。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析后Tukey HSD檢驗(yàn)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

為了更詳細(xì)地評估軟骨磨損情況，研究人員進(jìn)行了番紅O/快綠和甲苯胺藍(lán)染色。結(jié)果顯示，OA組表現(xiàn)出明顯的病理特征，如關(guān)節(jié)表面侵蝕和軟骨退化。雖然QUE組有所改善，但軟骨磨損仍較為嚴(yán)重，推測這可能是由于關(guān)節(jié)內(nèi)注射頻率低和藥物濃度不足所致。相比之下，M-CH@QUE組表現(xiàn)出了最佳療效，其次是CH@QUE組（圖9A-F）。使用Mankin評分系統(tǒng)對病理變化進(jìn)行評估，結(jié)果顯示M-CH@QUE組在三個治療組中得分最低，表明其病理變化最輕。此外，研究人員通過Col2免疫組化染色檢測軟骨中外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，OA組的Col2水平顯著降低，陽性染色較弱，反映了合成代謝活動受損。相反，治療組，尤其是M-CH@QUE組，表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的Col2染色和更多的陽性染色軟骨細(xì)胞，提示其增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞保護(hù)和外基質(zhì)的完整性（圖9G）。通過對大鼠軟骨中IGF1R、P-IGF1R和NOX4的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行評估，體內(nèi)研究表明，M-CH@QUE能夠促進(jìn)IGF1R的磷酸化，并減少AMOA進(jìn)展過程中的氧化應(yīng)激（圖9H, I）。總體而言，M-CH@QUE展示了顯著的治療效果。

圖9（A）大鼠脛骨軟骨的番紅O-固綠色染色和甲苯胺藍(lán)染色；（B）使用Mankin評分對6周時的大鼠脛骨軟骨損傷進(jìn)行定量分析（數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6）；（C）使用Mankin評分對12周時的大鼠脛骨軟骨損傷進(jìn)行定量分析（數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6）；（D）大鼠股骨軟骨的番紅O-固綠色染色和甲苯胺藍(lán)染色；（E）使用Mankin評分對6周時的大鼠股骨軟骨損傷進(jìn)行定量分析（數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n=6）；（F）使用Mankin評分對12周時的大鼠股骨軟骨損傷進(jìn)行定量分析（數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6）；（G）用于COL2可視化的免疫組化（IHC）染色；（H）Western blotting分析膝關(guān)節(jié)軟骨中NOX4、IGF-1R和P-IGF-1R的表達(dá)；（I）（H）的定量分析（n=3）。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析后Tukey HSD檢驗(yàn)，ns表示不顯著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001