IF：26.8 《AM》湖大史俊峰/澳門大學宋賀：Zingibroside R1：天然產物如何自組裝成抗真菌“利器”
專欄：學術前沿
發(fā)布日期：2025-06-23
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天然產物來源廣泛，具備多種治療潛力，已用于抗瘧疾（青蒿素）、抗腫瘤（紫杉醇）、鎮(zhèn)痛（嗎啡）和抗炎（阿司匹林）等藥物開發(fā)。然而，其低溶解性和生物利用度限制了臨床轉化，約90%的候選天然化合物因藥代動力學問題被淘汰。
為克服上述限制，已開發(fā)包括納米粒、膠束、脂質體和高分子水凝膠在內的多種藥物遞送系統(tǒng)。其中，基于天然產物或其衍生物構建的自組裝水凝膠因其良好的生物相容性、高藥物負載能力和可控釋放特性，成為炎癥治療、創(chuàng)面修復、抗菌和腫瘤治療等領域的潛在平臺。當前，自組裝水凝膠的理性設計仍面臨挑戰(zhàn)，主要原因在于缺乏對其分子結構和組裝機制的理解。水凝膠通常以納米纖維或納米管等形式呈現(xiàn)多級結構，其形成依賴疏水/親水作用力的精確平衡。傳統(tǒng)結構表征手段如負染電鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）雖可觀察納米尺度形貌，但無法解析分子間精細相互作用。
冷凍電鏡（cryo-EM）作為新興手段，已被用于蛋白質結構解析、肽-蛋白互作和超分子組裝研究，具備原子級分辨率，但在天然產物自組裝體系中的應用仍較少，相關結構機制研究尚不充分。
針對上述問題，湖南大學史俊峰/澳門大學宋賀團隊合作發(fā)現(xiàn)姜皂苷R1（ZR1）可自發(fā)組裝形成分子水凝膠。冷凍電鏡結果顯示，該水凝膠由ZR1單體通過氫鍵驅動形成納米原纖維結構，具備疏水性核心和親水性表面。相比游離態(tài)ZR1，水凝膠形式顯著增強其對白色念珠菌的抑制能力，表現(xiàn)為破壞菌體膜結構并導致細胞內容物泄漏。ZR1水凝膠可負載乳酸桿菌，在體外共培養(yǎng)體系中表現(xiàn)出對白色念珠菌的協(xié)同抑制作用。結構分析顯示，ZR1水凝膠可通過分子間作用與念珠菌細胞壁葡聚糖結合，實現(xiàn)靶向識別。在小鼠VVC模型中，ZR1-乳酸桿菌復合水凝膠處理組菌落數(shù)顯著降低，陰道組織炎癥程度減輕，菌群結構恢復趨于正常，表明該材料具備聯(lián)合抗真菌與調節(jié)陰道菌群的治療潛力。ZR1分子結構中穩(wěn)定的氫鍵網絡為水凝膠構建提供組裝基礎，水凝膠平臺兼具抗真菌活性與益生菌遞送能力，為VVC治療提供新型干預策略，并為其他難溶天然產物的水凝膠化設計提供示范。該文章于2025年5月6日以《Atomic Insights lnto Self-Assembly ofZingibroside Rl andits Therapeutic Action Against Fungal Diseases》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（https://doi.org/10.1002/adma.202503283）。
（1）ZR1凝膠的制備與表征
ZR1在PBS中可通過加熱-冷卻法自組裝形成透明自支撐水凝膠，最低凝膠化濃度為2.0 wt%（圖1a）。負染TEM顯示水凝膠由寬度約5 nm的均一納米原纖維構成，SEM觀察到內部為多孔結構（圖1b）。XRD分析顯示水凝膠具有明顯衍射峰，表明分子排列有序，而ZR1粉末中未見該結構（圖1c）。FT-IR光譜顯示羧基O─H伸縮振動增強，C═O不對稱與對稱伸縮振動紅移，提示氫鍵參與自組裝過程（圖1d）。ZR1水凝膠的zeta電位為 -38.3 ± 0.47 mV，顯示其穩(wěn)定性優(yōu)于游離態(tài)ZR1（圖1e）。流變學分析表明其具備典型的剪切稀化行為和良好的儲能模量恢復能力，表現(xiàn)出優(yōu)異的粘彈性能和自愈合特征（圖1f）。上述結果表明ZR1可自組裝形成結構穩(wěn)定、力學性能良好、具有良好生物相容性和附著性的水凝膠，具備進一步生物醫(yī)學應用潛力。
圖1. ZR1凝膠的形貌與凝膠性能表征。（a）加熱-冷卻法制備ZR1水凝膠的示意圖；（b）ZR1凝膠的SEM圖像（左）和TEM圖像（右）；（c）ZR1凝膠的XRD圖譜；（d）ZR1凝膠的FTIR光譜；（e）ZR1凝膠的Zeta電位測定結果；（f）ZR1凝膠在0.2%至500%應變循環(huán)下的儲能模量（G′）恢復性能，頻率為1 Hz，凝膠濃度為2.0 wt.%
（2）ZR1納米纖維的低溫電子顯微鏡結構
低溫電子顯微鏡（cryo-EM）結果顯示，ZR1分子可自組裝形成直徑約50 ?的管狀納米原纖維（圖2a）。2D分類顯示纖維片段具有約40 ?的周期性高分辨特征，寬度約為45.8 ?，提示其具備有序螺旋排列（圖2b）。功率譜分析觀察到延伸至4.3 ?分辨率的弱層線，第一層線與赤道間距對應的螺旋重復單元為38.6 ?（圖2c），與2D圖像中重復結構一致。根據(jù)功率譜索引結果構建三維密度圖，初步解析ZR1納米纖維的螺旋結構。因小分子缺乏典型二級結構，手性識別困難。通過分別在左手與右手螺旋模型中進行原子構建與實空間擬合，僅左手螺旋模型可容納ZR1手性結構，確認其為左手螺旋。進一步基于最佳擬合模型重構獲得分辨率為2.5 ?的三維密度圖，其螺旋上升步長為1.7 ?，扭轉角為?93.4°，形成螺距為154.4 ?的四股螺旋結構，投影重復單元為38.6 ?（圖2d,e）。該結構清晰顯示出三萜核心與雙糖側鏈的電子密度，可構建可靠原子模型（圖2f）。每個不對稱單元包含兩個ZR1分子，四個不對稱單元環(huán)繞納米纖維周向形成完整螺旋周期（圖2g）。
圖2. ZR1納米纖維的高分辨率冷凍電鏡結構表征。（a）ZR1納米纖維的代表性cryo-EM圖像，箭頭指示其形貌；（b）2D分類圖像顯示具有約45.8 ?寬度的螺旋組裝結構；（c）功率譜圖及對應的貝塞爾函數(shù)階數(shù)標注，用于計算螺旋扭轉與上升步長；（d，e）從側視圖與頂視圖觀察的ZR1納米纖維密度圖，標注纖維寬度與重復節(jié)距；（f）擬合左手螺旋結構的ZR1原子模型（頂視圖）；（g）不對稱單元內的ZR1分子結構，包括兩個分子MolA和MolB
（3）ZR1凝膠體外表現(xiàn)出抗真菌活性
ZR1凝膠對白色念珠菌表現(xiàn)出顯著抗真菌活性。平板計數(shù)結果顯示，2.0% ZR1凝膠組菌落形成單位（CFUs）顯著低于同濃度溶液組，二者均低于未處理組（圖3a）。在接種密度為1×102至1×10? CFUs的系列測試中，ZR1凝膠在高密度條件下仍可有效抑制菌落生長，抑制效果優(yōu)于ZR1溶液（圖3b）。SEM觀察顯示，ZR1凝膠處理后白色念珠菌細胞形態(tài)破壞明顯，表現(xiàn)為細胞膜凹陷、破裂或變形；而未處理組細胞呈完整卵圓狀（圖3c，左）。TEM進一步顯示，ZR1凝膠處理組細胞膜與細胞壁分離，胞質物質泄漏；對照組細胞結構完整、胞質均勻（圖3c，中、右）。共聚焦激光顯微鏡下的PI和Syto 9雙染結果表明，ZR1凝膠處理組細胞PI熒光顯著增強，Syto 9熒光減弱，提示膜通透性增加，細胞膜完整性受損（圖3d）。上述結果說明ZR1凝膠通過破壞白色念珠菌細胞膜結構，增強其膜通透性，導致細胞死亡，從而發(fā)揮抗真菌作用。
圖3. ZR1凝膠的體外抗真菌性能。（a）ZR1凝膠處理后白色念珠菌的平板計數(shù)結果（n = 3）；（b）不同初始接種量條件下ZR1凝膠對白色念珠菌生長的抑制效果評估（n = 3）；（c）ZR1凝膠作用4 h后白色念珠菌的SEM圖像（左）及TEM圖像（中、右）；比例尺分別為2 μm、1 μm和100 nm；（d）ZR1凝膠處理30 min后白色念珠菌經碘化丙啶和Syto 9染色的共聚焦激光顯微鏡圖像，比例尺為20 μm；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns表示差異無統(tǒng)計學意義
（4）ZR1凝膠抗真菌特性的分子洞察
ZR1凝膠對白色念珠菌細胞膜的破壞效應優(yōu)于游離態(tài)溶液，提示其納米纖維結構可能在該過程中發(fā)揮關鍵作用。3D結構分析顯示，ZR1分子沿螺旋軸方向通過羧基與羥基間的氫鍵穩(wěn)定排列（圖4a,b），三萜骨架朝向纖維內核，表面暴露親水性雙糖基團（圖4c），促進纖維間氫鍵作用（圖4d），實現(xiàn)內疏水、外親水的構型（圖4e），有利于與細胞膜接觸與干擾。密度泛函理論（DFT）與獨立梯度模型（IGMH）分析顯示，ZR1與β-1,3-葡聚糖之間存在穩(wěn)定氫鍵，作用能為約?0.76 eV，表明其對白色念珠菌細胞壁具有較高親和力（圖4f）。分子動力學模擬顯示，ZR1納米纖維可與POPC磷脂發(fā)生顯著相互作用（圖4g,h）。結果表明，ZR1納米纖維通過識別并結合細胞壁葡聚糖，將其錨定于真菌膜表面，進而通過膜結構擾動實現(xiàn)抗真菌活性，呈現(xiàn)細胞壁識別與膜破壞的雙重作用機制。
圖4. ZR1納米纖維組裝在抗真菌活性中的分子機制。（a）ZR1納米纖維結構模型側視圖；（b）螺旋軸方向上的分子間相互作用；（c）ZR1納米纖維頂視圖；（d）相鄰原原纖維間的分子作用模式；（e）ZR1結構模型頂視圖，疏水原子以棒狀表示，極性原子以紅球表示；（f）ZR1納米纖維與β-1,3-葡聚糖相互作用的DFT計算結果；（g）分子動力學模擬中ZR1凝膠與細胞膜相互作用的初始狀態(tài)與最終狀態(tài)；（h）細胞膜在初始與最終狀態(tài)下的空間分布投影圖，X軸與Y軸表示膜模型的長度（單位：納米）
（5）LGG@ZR1 可在小鼠體內抑制 VVC
在小鼠外陰陰道念珠菌?。╒VC）模型中，ZR1凝膠和LGG@ZR1復合物展現(xiàn)出良好治療效果。雌性BALB/c小鼠經雌激素預處理后陰道接種2 × 10? CFUs白色念珠菌建立VVC模型，感染確認后連續(xù)9天給予不同治療，包括LGG、ZR1凝膠、LGG@ZR1復合物和伊曲康唑（對照藥物）（圖5a）。外陰觀察顯示，LGG@ZR1組在第5天炎癥顯著緩解，分泌物減少，紅腫消失明顯，優(yōu)于其他組（圖5b）。H&E和PAS染色顯示，LGG@ZR1組陰道上皮結構完整，炎癥反應及真菌殘留較輕，近似于健康對照組；PBS組表現(xiàn)為上皮結構破壞和中性粒細胞大量浸潤（圖5c,d），其他處理組仍存在真菌殘留，提示LGG@ZR1具備良好組織修復與抗真菌能力。16S rDNA測序結果顯示，LGG@ZR1組陰道微生態(tài)多樣性（OTU數(shù)、α-及β-多樣性）顯著高于伊曲康唑組，接近健康組水平（圖5e,f）。菌群組成上，LGG@ZR1處理顯著增加厚壁菌門（Firmicutes）比例，降低變形菌門（Proteobacteria）豐度（圖5g），恢復至更接近健康狀態(tài)的微生態(tài)結構。綜上，LGG@ZR1在體內表現(xiàn)出優(yōu)于伊曲康唑的抗VVC療效，具有抗真菌、抗炎、免疫調節(jié)及陰道微生態(tài)修復的多重功能，具備潛在臨床應用前景。
圖5. LGG@ZR1對小鼠VVC模型的體內治療效果。（a）VVC建模、治療與檢測的實驗流程圖及不同處理組小鼠陰道外觀圖；（b）健康組、VVC模型組及LGG、ZR1凝膠、LGG@ZR1、伊曲康唑治療組小鼠的外觀圖像（n = 5）；（c,d）各組小鼠陰道組織的H&E染色與PAS染色圖像，比例尺：100 μm；（e,f）各組陰道菌群的α多樣性（Chao）與β多樣性（PCoA）指數(shù)，數(shù)據(jù)以幾何均值 ± SEM 表示（n = 5），P值采用Student’s t檢驗計算；（g）各處理組在門水平的菌群相對豐度熱圖
本研究以低溶解性、低生物利用度的三萜皂苷類天然產物姜皂苷R1（ZR1）為模型，發(fā)現(xiàn)其無需結構修飾即可自組裝形成水凝膠。采用冷凍電鏡解析了其納米原纖維的原子結構，分辨率達2.5 ?，為目前已報道的首個由天然產物自組裝形成并經cryo-EM解析的納米纖維結構。 ZR1自組裝后的三維結構顯著增強其抗真菌活性，該構象可富集有效分子，提升其與真菌膜的作用效率。纖維表面暴露的親水基團促進其附著于細胞膜，通過分子相互作用破壞真菌膜結構。此外，ZR1水凝膠可負載益生菌乳酸桿菌，實現(xiàn)抗真菌與微生態(tài)修復的雙重功能。ZR1與益生菌協(xié)同抑制白色念珠菌，同時促進陰道菌群恢復，降低VVC復發(fā)風險，提供更全面的治療策略。該水凝膠系統(tǒng)在治療口腔念珠菌病和真菌性腸炎等方面亦具有潛在應用價值。 綜上，ZR1水凝膠是一種兼具抗真菌與益生菌遞送能力的多功能治療平臺，其獨特的納米纖維結構在生物活性增強中發(fā)揮關鍵作用，為天然產物在水凝膠構建與藥物開發(fā)中的應用提供了新思路，拓展了其在臨床干預中的潛力。
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