三亚老牛影院在线观看_无码av永久免费专区男男_无套中出丰满人妻无码_国产成久热这里只有精品视频6_欧美人妻色网视频_天天躁夜夜躁狠狠躁2021牛牛_linode日本成熟iphone69医生_国产亚洲人成网站在线观看4_国产乱伦精品一区二区_免费的一级片网站

針對上述問題，南京工業(yè)大學董曉臣教授開發(fā)了一種基于硫化鉍（Bi₂S₃）的I型光動力抗菌納米協(xié)同劑，并將其整合到可溶性微針貼片中，用于治療細菌生物膜感染傷口。研究通過缺陷工程和形貌調(diào)控制備了富含缺陷的海膽狀硫化鉍納米顆粒，并在其表面包裹兒茶酚-鎵離子（Ga³⁺）復合物，形成BSPG納米顆粒，再將其嵌入透明質(zhì)酸基微針矩陣中。該微針貼片能夠穿透皮膚/生物膜屏障，釋放納米顆粒穿透細菌膜，在808 nm激光照射下，BSPG可產(chǎn)生過氧化氫和超氧陰離子，滅活細菌。同時，在酸性生物膜環(huán)境中，釋放的Ga³⁺可干擾細菌抗氧化防御機制，增強光動力抗菌效果。體外和體內(nèi)實驗表明，該微針貼片能有效清除生物膜，減輕炎癥反應(yīng)，加速傷口愈合，為治療復雜生物膜感染傷口提供了新思路。該文章于2025年6月16日以《Bismuth Sulfide Microneedle Patch for MRSA Biofilm Removal via Oxidative Stress Amplification》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202507540）。

生物膜感染傷口治療示意圖。（a）BSPG微針貼片制備的示意圖；（b）BSPG微針貼片破壞生物膜屏障并促進傷口愈合的機制

(1) BSPG的合成與表征

通過聚乙烯吡咯烷酮輔助自組裝策略，在乙二醇中合成了海膽狀硫化鉍（BS）。如圖1a所示，BS具有明確的海膽狀形態(tài)，平均尺寸為2 μm，高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖像（圖1b）顯示BS表面存在缺陷。為了制備鎵離子（Ga³⁺）功能化的BS（BSPG），在BS表面涂覆了聚多巴胺（PDA）層，并通過Ga³⁺與兒茶酚配位形成復合物將Ga³⁺負載到PDA殼中，如圖1c所示，Ga³⁺負載后BSPG的結(jié)構(gòu)與BS相似，但表面有一層薄而均勻的聚合物涂層（圖1d），且元素分布圖（圖1e）顯示Bi、S、N和Ga四種元素在BSPG中均勻分布。XPS光譜（圖1f）確認Ga以Ga³⁺形式存在，而非晶態(tài)鎵，拉曼光譜（圖1g）進一步證實了Ga³⁺與PDA的配位作用。實驗表明，BSPG在酸性條件下（pH 5.5）釋放Ga³⁺的速率高于中性條件（pH 7.4）（圖1h）。通過2’,7’-二氯熒光素（DCFH）熒光探針驗證了BSPG的光動力性能（圖1i），結(jié)果顯示，BSPG在激光照射下可產(chǎn)生活性氧（ROS），且其生成效率高于BS。此外，利用二氫乙錠（DHE）和DHR123探針分別檢測了超氧陰離子（O^2-）和過氧化氫（H2O2）的生成（圖1j和圖1k），表明BSPG的ROS生成機制主要遵循I型光動力途徑，通過電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生ROS，不依賴氧氣，適用于厭氧生物膜環(huán)境。

圖1.BS和BSPG的表征。（a）BS的掃描電鏡（SEM）圖像；（b）BS的高分辨透射電鏡（HRTEM）圖像；（c，d）BSPG的透射電鏡（TEM）圖像；（e）BSPG的元素分布；（f）BSPG的X射線光電子能譜（XPS）Ga 3d軌道譜；（g）不同材料的拉曼光譜分析；（h）BSPG在不同pH條件下的Ga³⁺釋放曲線；（i）利用DCFH探針評估BSPG的總ROS生成；（j）利用DHE探針評估O^2-生成；（k）利用DHR123探針評估H₂O₂生成

（2）BSPG的體外抗菌和抗生物膜活性

為了評估BSPG的光動力抗菌活性，將大腸桿菌（E. coli）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）與不同濃度的BSPG（0–128 μg/mL）共孵育，并暴露于808 nm激光下10分鐘。圖2a和圖2b顯示，經(jīng)過12小時孵育后，E. coli和MRSA的存活率隨著BSPG濃度的增加顯著降低，在pH 5.5條件下，BSPG對E. coli的最小殺菌濃度（MBC）為32 μg/mL，對MRSA為64 μg/mL。在pH 7.4條件下，BSPG對E. coli的MBC為64 μg/mL，對MRSA為128 μg/mL，這種差異源于兩種細菌細胞壁結(jié)構(gòu)的不同：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）作為革蘭氏陽性菌，其厚的肽聚糖層對BSPG誘導的損傷（如物理穿孔和ROS介導的損傷）具有顯著的保護作用，而大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌，其外層結(jié)構(gòu)較薄，更容易受到BSPG等外界因素的影響。因此，BSPG對E. coli的抗菌效果顯著優(yōu)于MRSA。在后續(xù)實驗中，主要以MRSA為對象進行抗菌評估，圖2c顯示，與對照組相比，BSPG+激光（L）處理組的細菌數(shù)量減少了近6.5個對數(shù)級，平板上幾乎無菌落（經(jīng)103倍稀釋后），而單獨使用BSPG或Ga³⁺處理的組僅分別減少了1.6和2.5個對數(shù)級，平板上仍有大量菌落。為了驗證I型光動力療法在缺氧環(huán)境中的有效性，使用缺氧袋對比了BSPG在常氧和缺氧條件下的抗菌性能（圖2g）。圖2d顯示，無論在常氧還是缺氧條件下，BSPG+L處理均能減少6個對數(shù)級的細菌，活/死熒光染色結(jié)果（綠色：活菌，紅色：死菌）表明，BSPG+L處理組顯示出最明顯的紅色熒光信號，進一步證實了其最佳的抗菌效果（圖2e），常氧和缺氧條件下的活/死染色結(jié)果與平板實驗結(jié)果一致（圖2d），證明BSPG的抗菌效果不受感染環(huán)境氧水平的限制。此外，掃描電鏡（SEM）觀察結(jié)果顯示，在PBS和PBS+L組中，細菌保持完整的球形結(jié)構(gòu)，細胞壁未受損（圖2f）。BSPG-L組與PBS組相比僅有輕微差異，而BSPG+L處理組的細菌不再呈典型球形，細胞壁出現(xiàn)大量凹陷和塌陷。

圖2. BSPG的體外抗菌活性。（a）不同pH條件下，經(jīng)不同濃度BSPG處理后大腸桿菌的存活率；（b）耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的存活率；（c）不同處理后存活MRSA的定量分析；（d）常氧和缺氧條件下，經(jīng)BSPG處理后MRSA的菌落形成單位（CFUs）/mL定量分析；（e）不同處理后MRSA的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像；（f）不同處理后MRSA的掃描電鏡（SEM）圖像；（g）缺氧抗菌實驗示意圖

（3）BSPG的潛在抗菌機制

通過Calcein AM探針檢測生物膜內(nèi)活菌來評估BSPG的抗生物膜活性。如圖3a所示，對照組生物膜結(jié)構(gòu)完整，熒光信號強；硝酸鎵處理組因Ga³⁺的抗菌性熒光略有下降，與平板計數(shù)結(jié)果一致；BSPG-L處理組生物膜結(jié)構(gòu)變化不大，但抗菌活性增強；BS+L和BSP+L組熒光顯著減弱但仍存信號，表明部分細菌存活；而BSPG+L組幾乎無綠色熒光，說明生物膜中大部分細菌被破壞。圖3b的菌落統(tǒng)計結(jié)果和圖3c的結(jié)晶紫染色分析進一步確認BSPG+L通過I型光動力抗菌療法和Ga³⁺抗菌療法展現(xiàn)出更強的抗菌活性。本研究制備的BSPG納米顆粒具有膽海狀形態(tài)，其表面的刺狀結(jié)構(gòu)對細菌的捕獲和穿透細菌細胞膜具有顯著影響。實驗結(jié)果表明，BSPG表面的刺狀結(jié)構(gòu)不僅有效促進了細菌在其表面的聚集，還成功穿透了細菌細胞膜（圖3d），這可能有助于后續(xù)過程中Ga³⁺的局部釋放（圖3e）。此外，Ga³⁺已被證實能夠破壞細菌的鐵平衡，從而削弱其抗氧化系統(tǒng)。因此，研究進一步探討了Ga³⁺與光動力療法（PDT）的協(xié)同抗菌效果。結(jié)果顯示，與對照組相比，僅用BS處理的組中細菌的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性增加，這是由于PDT產(chǎn)生的活性氧（ROS）誘導了細菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而觸發(fā)了抗氧化酶活性的代償性上調(diào)以對抗氧化損傷。然而，在硝酸鎵和BSPG處理的組中，MRSA的SOD和CAT活性顯著降低（圖3f），表明BSPG能夠抑制細菌的抗氧化防御機制。通過藥物相互作用系數(shù)（CDI）評估Ga³⁺與PDT的協(xié)同效應(yīng)結(jié)果表明，對于MRSA，單獨使用Ga³⁺（16.25 μg/mL）或BS（32 μg/mL）處理時，細菌存活率分別為97.44%和76.44%，而聯(lián)合使用Ga³⁺和BS處理時，存活率降至9%，計算得出CDI值為0.121，同樣，當使用更高濃度的Ga³⁺（32.5 μg/mL）或BS（64 μg/mL）單獨處理時，存活率分別為93.22%和11.99%，而聯(lián)合處理進一步將存活率降至3.33%，對應(yīng)的CDI值為0.298（圖3g）。在兩種情況下，CDI值均顯著低于0.7，表明Ga3?與BS聯(lián)合處理的抗菌活性并非簡單的加和效應(yīng)，具有而是顯著的協(xié)同作用。

圖3. BSPG的抗菌機制。（a）不同處理后MRSA生物膜的熒光圖像及其對應(yīng)的橫截面圖像；（b）平板上的菌落形成單位（CFU）計數(shù)；（c）不同處理后結(jié)晶紫染色的生物膜圖像及其在630 nm處的吸光度值；（d）展示BSPG捕獲和穿透MRSA的代表性掃描電鏡（SEM）圖像；（e）BSPG在酸性感染微環(huán)境中殺菌機制的示意圖；（f）經(jīng)硝酸鎵（16 μg/mL）和BSPG納米顆粒（32 μg/mL）處理后MRSA的過氧化氫酶（CAT）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性；（g）不同處理下MRSA的存活率

為了進一步探究BSPG的抗菌機制，對經(jīng)BSPG處理后的MRSA進行了原核轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析，以鑒定差異表達基因（DEGs）。結(jié)果顯示，與對照組相比，共有2124個基因表達發(fā)生顯著變化，其中236個基因上調(diào)，385個基因下調(diào)（圖4a，b），表明BSPG處理后MRSA的轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了顯著變化。通過基因本體（GO）富集分析發(fā)現(xiàn)，包括鐵硫簇結(jié)合、營養(yǎng)水平響應(yīng)、精氨酸代謝過程和谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程等在內(nèi)的多個基因類別在BSPG處理后被下調(diào)（圖4c），這表明BSPG干擾了細菌的能量代謝并削弱了其應(yīng)對氧化應(yīng)激的能力。同時，上調(diào)的GO類別包括脂質(zhì)氧化、氧化應(yīng)激響應(yīng)、細胞氧化應(yīng)激響應(yīng)和鐵離子跨膜運輸?shù)龋▓D4d），證實了MRSA細胞中發(fā)生了氧化損傷，并導致脂質(zhì)過氧化物的大量積累。此外，KEGG富集分析將DEGs分類到多種代謝途徑中，其中上調(diào)的DEGs主要涉及糖酵解、嘌呤代謝、RNA降解和脂肪酸降解等86條途徑；而下調(diào)的DEGs主要集中在ABC轉(zhuǎn)運蛋白、氮代謝、嘧啶代謝和半胱氨酸及蛋氨酸代謝等82條途徑（圖4e），這些結(jié)果表明，這些代謝途徑在BSPG抑制MRSA活性過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖4. MRSA經(jīng)BSPG處理后的轉(zhuǎn)錄組變化。（a）差異表達基因（DEGs）分布的火山圖；（b）差異表達基因（DEGs）分布的餅圖；（c）下調(diào)DEGs的基因本體（GO）富集分析；（d）上調(diào)DEGs的基因本體（GO）富集分析；（e）上調(diào)和下調(diào)DEGs在KEGG通路中的富集分析

（4）PCR驗證基因表達水平

利用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測了與鐵穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激調(diào)控相關(guān)的差異表達基因（DEGs）的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，MRSA在經(jīng)BSPG處理后，fur基因表達下調(diào)，feoB基因表達上調(diào)（圖5a，b），表明細菌內(nèi)部鐵穩(wěn)態(tài)失衡。同時，抗氧化酶相關(guān)基因（如gpx、sodA、katE和ahpC）的表達上調(diào)（圖5c–g），說明細菌的抗氧化系統(tǒng)在BSPG處理下被激活。此外，編碼琥珀酸脫氫酶亞基A的sdhA基因表達呈下降趨勢（圖5h），這會減少電子傳遞鏈中的電子供應(yīng)，抑制ATP合成過程，從而影響細菌代謝。研究假設(shè)BSPG破壞細菌鐵穩(wěn)態(tài)并誘導氧化還原失衡，其關(guān)鍵特征是細胞膜中不飽和脂肪酸的氧化，導致脂質(zhì)過氧化物（LPO）的形成。結(jié)果顯示，經(jīng)BSPG+激光（L）處理的細菌中ROS含量顯著高于對照組（圖5i）。LPO水平檢測表明，BSPG單獨處理和BSPG+L處理組的LPO水平均顯著高于對照組（圖5j）。此外，丙二醛（MDA）作為LPO降解的產(chǎn)物，在BSPG+L處理后也顯著增加（圖5k）。轉(zhuǎn)錄組分析顯示BSPG+L處理影響了細菌的糖酵解過程（圖4e）。圖5l顯示，經(jīng)BSPG處理的細菌中ATP水平較對照組降低，BSPG+L組降低更為顯著。最后，通過o-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）探針檢測細菌通透性，結(jié)果顯示BSPG處理組的ONPG攝取顯著高于對照組（圖5m），表明BSPG處理對細菌細胞膜造成了嚴重損傷。

圖5. PCR驗證基因表達水平。（a–h）經(jīng)BSPG處理后金黃色葡萄球菌中鐵穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激調(diào)控相關(guān)DEGs的qPCR分析；（i）不同處理后細菌中ROS含量；（j）不同處理后細菌中LPO含量；（k）在近紅外激光照射（808 nm，1 W/cm2，10分鐘）下，經(jīng)不同濃度BSPG處理的細菌產(chǎn)生的丙二醛（MDA）含量；（l）不同處理后金黃色葡萄球菌中ATP濃度；（m）通過ONPG測定金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的變化

（5）BSPG微針貼片的治療效果評估

細菌生物膜是導致60%慢性傷口和6%急性傷口愈合延遲的原因，生物膜基質(zhì)屏障和皮膚屏障的存在使得治療藥物難以直接與細菌接觸，為此，將BSPG裝載到可生物降解的微針（MN）貼片中，用于增強體內(nèi)BSPG的遞送（圖6a）。具體方法是將含有BSPG納米顆粒的透明質(zhì)酸溶液注入模具腔體中，抽真空并加熱以形成可生物降解的針尖。掃描電鏡（SEM）圖像顯示，制備的BSPG微針貼片具有高度為600微米、基底直徑為250微米的尖銳錐形結(jié)構(gòu)（圖6b），證實了微針貼片能夠穿透生物膜感染傷口表面的皮膚屏障，并將藥物直接遞送至目標部位。構(gòu)建了MRSA生物膜感染傷口模型以評估微針（MN）貼片的治療潛力，感染小鼠隨機分為五組：對照組、BSPG組、BSPG+激光（L）組、BSPG微針組和BSPG微針+激光組，動物實驗過程如圖6c所示。治療期間，使用數(shù)碼相機跟蹤記錄小鼠傷口愈合情況。如圖6d–f所示，經(jīng)過10天治療，對照組感染傷口面積縮小至原始面積的51.7%；BSPG組傷口面積縮小28%；BSPG微針組傷口面積縮小至24.8%，略小于BSPG組，可能是由于微針貼片增強了穿透效果。值得注意的是，BSPG微針+激光組的感染傷口在第10天幾乎完全愈合，傷口面積縮小至12.8%，表明在激光照射下，BSPG微針貼片更有效地加速了傷口愈合。進一步探究其機制，第10天將傷口組織勻漿后，采用平板計數(shù)法評估細菌存活情況，如圖6g所示，BSPG微針+激光組存活細菌極少，僅1.20%存活，遠低于BSPG+激光組的7.52%，證實BSPG微針因微針穿刺作用幫助BSPG突破細菌生物膜，展現(xiàn)出更強的抗菌生物膜感染效果。此外，治療期間小鼠體重無顯著變化（圖6h），表明BSPG微針+激光治療在短期內(nèi)無明顯毒性。

圖6. BSPG微針貼片的體內(nèi)治療效果評估。（a）BSPG微針穿透生物膜感染傷口的示意圖；（b）BSPG微針的掃描電鏡（SEM）圖像；（c）MRSA生物膜感染傷口治療的示意圖；（d）各治療組在治療前1天、第0天、第2天、第4天、第6天、第8天和第10天的感染傷口代表性圖像，以及（e）對應(yīng)的傷口面積統(tǒng)計；（f）傷口面積隨時間的變化；（g）感染組織樣本中MRSA的存活率；（h）治療期間小鼠體重的變化

通過蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson三色染色進一步評估傷口愈合進程。結(jié)果顯示，第4天各組皮膚結(jié)構(gòu)均不完整，膠原沉積不明顯（圖7a）。到第10天，對照組、BSPG組和BSPG微針組的皮膚仍存在損傷，而BSPG+激光（L）組和BSPG微針+激光組的皮膚相對完整且排列有序，其中BSPG微針+激光組的膠原沉積和皮膚完整性最為顯著，與未感染小鼠的傷口愈合過程最為相似。此外，在評估BSPG微針的抗感染效果時發(fā)現(xiàn)，第4天各組促炎因子IL-1β表達均較高（圖7b，c），但到第10天，BSPG微針+激光組的IL-1β水平最低，抗炎因子Arg-1表達最高（圖7d）。這些結(jié)果表明，BSPG微針不僅能清除感染區(qū)域的致病菌，還能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)加速傷口愈合?？傮w而言，BSPG微針有助于BSPG突破生物膜屏障，增強其對細菌生物膜感染的治療效果，并通過增加膠原沉積和減輕炎癥反應(yīng)促進傷口愈合。

圖7. 病理學染色驗證修復效果。（a）治療第4天和第10天感染傷口組織的蘇木精-伊紅（H&E）染色和Masson三色染色代表性圖像；（b）治療第4天和第10天IL-1β和Arg-1的代表性免疫熒光圖像；（c）定量分析圖b中第4天的熒光強度；（d）定量分析圖b中第10天的熒光強度