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針對慢性傷口治療中電刺激療法的局限性，四川大學(xué)高少慶/孫強(qiáng)團(tuán)隊開發(fā)了一種自供電熱電水凝膠敷料。該敷料由銀硒化物（Ag?Se）和甲基丙烯酰化明膠（GelMA）組成，能夠利用傷口與環(huán)境之間的溫差產(chǎn)生電場，從而增強(qiáng)內(nèi)源性電場。這種增強(qiáng)的電場可以有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，加速傷口的閉合，為慢性傷口的治療提供了一種更加便捷和有效的解決方案。相關(guān)成果以《Self-Powered Thermoelectric Hydrogels Accelerate Wound Healing》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c01742）。   

Ag?Se@GelMA水凝膠電刺激裝置的制備及生物機(jī)制示意圖

（1）Ag?Se@GelMA復(fù)合水凝膠的表征

科研人員合成Ag?Se納米粒子（NPs），并以明膠甲基丙烯酸酯（GelMA）為生物相容性支架，用于治療劑輸送。圖1a的SEM圖像顯示Ag?Se納米粒子形態(tài)均勻，平均粒徑150納米；EDS分析表明Ag、Se和C元素均勻分布，證實其純化學(xué)組成。圖1b的明場TEM和HRTEM圖像顯示納米粒子具有{022}和{100}晶面的晶格條紋，分別為2.6 ?和4.3 ?，確認(rèn)了β-Ag?Se晶體結(jié)構(gòu)。圖1c的XRD圖譜表明Ag?Se納米粒子符合正交晶系A(chǔ)g?Se結(jié)構(gòu)，晶格參數(shù)為a=4.33 ?，b=7.06 ?，c=7.76 ?。圖1d的XPS譜圖顯示出Ag 3d和Se 3d的特征峰，證實其原始性質(zhì)。通過紫外線誘導(dǎo)光交聯(lián)制備Ag?Se@GelMA水凝膠，圖1g展示了前體物質(zhì)和水凝膠。冷凍干燥后的SEM表征顯示，水凝膠在Ag?Se質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.0%至1.5%范圍內(nèi)呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，且EDS分析證實Ag?Se納米粒子在水凝膠中均勻分布。此外，該水凝膠對多種組織界面展現(xiàn)良好粘附性，適用于傷口敷料。圖1k顯示，室溫下，Ag?Se@GelMA水凝膠的塞貝克系數(shù)（S）和電導(dǎo)率（σ）隨Ag?Se濃度增加而增大，1.0% Ag?Se時趨于穩(wěn)定，功率因子（PF）隨Ag?Se負(fù)載量增加而增大。含有1.0% Ag?Se的水凝膠在室溫下實現(xiàn)約1080 μV/K的S和約0.9 mS/cm的σ，可建立傷口部位的導(dǎo)電微環(huán)境。

圖1 Ag?Se@GelMA水凝膠的表征和性能。（a）Ag?Se納米粒子（NPs）的低倍SEM圖像及C、Ag、Se元素分布圖；（b）Ag?Se NPs的明場TEM和HRTEM圖像；（c）XRD圖譜；（d）Ag?Se NPs的XPS全譜；（e，f）Ag?Se NPs中Ag和Se元素的XPS譜圖；（g）含Ag?Se NPs的GelMA前體及光固化后的Ag?Se@GelMA水凝膠數(shù)碼照片；（h）不同Ag?Se濃度（0.0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.5 wt%）的Ag?Se@GelMA水凝膠SEM圖像及EDS圖；（i）Ag?Se@GelMA水凝膠在皮膚、肝臟、腎臟、腸道和脾臟等組織上的濕附著性能；（j，k）不同濃度Ag?Se NPs的Ag?Se@GelMA水凝膠的塞貝克系數(shù)S、電導(dǎo)率σ和功率因子PF；（l，m）Ag?Se@GelMA水凝膠對氣流和物體接觸刺激的電壓輸出，展示其環(huán)境響應(yīng)性電刺激（ES）能力

（2）Ag?Se@GelMA 水凝膠對增殖、遷移和血管生成的體外影響

科研人員通過Calcein-AM/PI染色分析培養(yǎng)的HUVECs的生物相容性（圖2a、2b）。結(jié)果顯示，GelMA、Ag?Se@GelMA和Ag?Se@GelMA+ES處理對HUVECs均無不利影響，表明Ag?Se@GelMA水凝膠生物相容性良好且電場強(qiáng)度適中。劃痕愈合實驗表明，Ag?Se@GelMA+ES處理顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移（圖2c），36小時后細(xì)胞遷移效果顯著增強(qiáng)。CCK-8細(xì)胞活性測定進(jìn)一步證實了Ag?Se@GelMA水凝膠的高生物相容性（圖2d）。  

為評估Ag?Se@GelMA水凝膠聯(lián)合ES對血管生成的影響，檢測了血管生成相關(guān)蛋白VEGF和vWF的表達(dá)水平。Western blotting（圖2e、2f）和免疫熒光染色（圖2g、2i）結(jié)果顯示，Ag?Se@GelMA+ES組顯著上調(diào)VEGF和vWF的表達(dá)。管狀結(jié)構(gòu)形成實驗表明，Ag?Se@GelMA+ES組中管狀長度和連接數(shù)顯著高于其他組（圖2h），表明Ag?Se@GelMA水凝膠ES裝置通過電刺激有效增強(qiáng)了血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)并促進(jìn)了血管生成。

圖2 Ag?Se@GelMA水凝膠的體外細(xì)胞毒性評估和促血管生成效應(yīng)。（a）HUVECs的活細(xì)胞/死細(xì)胞熒光成像；（b）死細(xì)胞比例的量化分析；（c）HUVECs劃痕傷口遷移實驗圖像（12、24、48小時）；（d）培養(yǎng)48小時后HUVECs的CCK-8細(xì)胞活性檢測；（e）HUVECs中VEGF和vWF的Western blotting圖像；（f）以β-actin為內(nèi)參的定量分析；（g）HUVECs的免疫熒光圖像，顯示VEGF和vWF表達(dá)；（h）HUVECs細(xì)胞形態(tài)的光學(xué)顯微鏡圖像；（i）6孔板中接種的HUVEC細(xì)胞VEGF和vWF表達(dá)的量化分析；（j）管狀長度和每個視野連接數(shù)的量化分析

（3）Ag?Se@GelMA 水凝膠對調(diào)節(jié)電壓門控鈣離子通道和線粒體結(jié)構(gòu)的體外機(jī)制研究

電刺激（ES）可顯著影響細(xì)胞行為，特別是內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，可能通過激活CaMKKβ/AMPK/Nrf2信號通路影響血管生成。圖3展示了Ag?Se@GelMA水凝膠和ES對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）線粒體功能和血管生成的影響。圖3a為機(jī)制示意圖。圖3b顯示，Ag?Se@GelMA+ES組細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度顯著高于對照組、GelMA組和Ag?Se@GelMA組。圖3c和圖3d表明，該組CaMKKβ、AMPK、P-AMPK和Nrf2表達(dá)水平顯著上調(diào)。圖3e為不同處理后HUVECs的熒光圖像，圖3f對線粒體形態(tài)和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)Ag?Se@GelMA+ES處理使線粒體形成延長、相互連接的形態(tài)。透射電子顯微鏡（TEM）圖像（圖3g）進(jìn)一步證實了線粒體的延長形態(tài)。圖4a和圖4b顯示，使用細(xì)胞膜Ca2?通道阻斷劑GdCl?可降低細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，而引入Ag?Se@GelMA+ES后，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度增加。圖4c表明，在GdCl?存在時，Ag?Se@GelMA+ES處理可顯著恢復(fù)CaMKKβ、AMPK和Nrf2等關(guān)鍵分子的表達(dá)。圖4d和圖4e顯示，GdCl?阻斷Ca2?通道導(dǎo)致線粒體碎片化，而Ag?Se@GelMA+ES處理使線粒體呈現(xiàn)延長、桿狀形態(tài)。圖4f和圖4g驗證了Ag?Se@GelMA+ES處理可上調(diào)VEGF和vWF等血管生成標(biāo)志物的表達(dá)，且這種上調(diào)在抑制組中受到抑制。這些結(jié)果明確了電刺激引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度變化、CaMKKβ/AMPK/Nrf2信號通路激活與線粒體結(jié)構(gòu)改變之間的聯(lián)系，進(jìn)一步促進(jìn)了血管生成和傷口愈合。

圖3 Ag?Se@GelMA水凝膠和電刺激（ES）對線粒體功能調(diào)節(jié)的體外影響。（a）激活VGCCs和鈣內(nèi)流進(jìn)而激活CaMKKβ/AMPK/Nrf2信號通路的機(jī)制示意圖；（b）用Fluo-3 AM對HUVECs細(xì)胞內(nèi)Ca2?水平染色的熒光圖像及定量分析；（c）不同處理下HUVECs中CaMKKβ、AMPK、P-AMPK和Nrf2的Western blotting圖像；（d）對應(yīng)的定量分析；（e）用線粒體示蹤劑Red對HUVECs染色的熒光圖像；（f）線粒體形態(tài)和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析，插圖為（e）中放大區(qū)域，比例尺10 μm；（g）不同處理下HUVECs線粒體形態(tài)演變的TEM圖像

圖4 Ag?Se@GelMA水凝膠的體外機(jī)制研究。使用細(xì)胞膜Ca2?通道阻斷劑（GdCl?），(a) Fluo-3 AM 染色的 HUVECs 細(xì)胞內(nèi) Ca2? 水平熒光圖像；(b) 定量分析；(c) HUVECs 中 CaMKKβ、AMPK、P-AMPK 和 Nrf2 的 Western blotting（WB）圖像及定量分析；(d) 線粒體示蹤劑 Red 染色的 HUVECs 熒光圖像；(e) 平均長寬比和平均形狀因子的統(tǒng)計分析；(f) HUVECs 中 VEGF、vWF 和 β-actin 表達(dá)水平的 WB 圖像及定量分析；(g) HUVECs 中 VEGF 和 vWF 表達(dá)的熒光圖像及量化分析

（4）Ag?Se@GelMA 水凝膠敷料對傷口愈合的體內(nèi)影響

在動物實驗中，Ag?Se@GelMA水凝膠敷料通過蒸發(fā)冷卻效應(yīng)在傷口區(qū)域產(chǎn)生電場，顯著促進(jìn)傷口愈合。實驗將大鼠分為PBS組、GelMA組、Ag?Se分散液組和Ag?Se@GelMA組，觀察術(shù)后0、3、6、9、12和15天的傷口情況。結(jié)果顯示，Ag?Se@GelMA組在第3天傷口閉合率約為30%，顯著高于對照組（不到20%）；第9天傷口收縮率達(dá)到84.97%，遠(yuǎn)超對照組的69.45%；第12天時，該組僅剩3.74%未愈合區(qū)域，而對照組第12天才實現(xiàn)超過90%的愈合效果。第15天，Ag?Se@GelMA組傷口幾乎完全閉合（圖5c、圖5d、圖5e）。組織學(xué)分析表明，Ag?Se@GelMA組傷口區(qū)域的再生表皮和真皮組織結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，毛囊和新生血管組織廣泛分布，膠原蛋白沉積增多，肉芽組織增厚（圖5f、圖5g、圖5h至圖5k）。此外，Ag?Se@GelMA組在第15天的VEGF和vWF表達(dá)水平顯著高于其他組（圖6a、圖6b），表明其具有出色的促血管生成能力。該水凝膠還可顯著增強(qiáng)Nrf2和AMPK活性（圖6c、圖6d），通過調(diào)節(jié)線粒體功能增強(qiáng)能量代謝，加速傷口修復(fù)。在炎癥方面，Ag?Se@GelMA組中TGF-β和IL-10表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖6e、圖6f），表明炎癥得到有效抑制。

圖5 Ag?Se@GelMA水凝膠敷料對傷口愈合和重塑的體內(nèi)影響。 (a) 15天動物實驗過程示意圖；(b) 25°C下帶有Ag?Se@GelMA水凝膠敷料的小鼠示意圖及熱紅外圖像顯示水凝膠溫度梯度；(c) 術(shù)后0、3、6、9、12和15天不同治療組未愈合傷口區(qū)域的代表性數(shù)碼照片，觀察圈模擬原始9 mm傷口；(d) 偽彩色疊加顯示不同愈合階段的傷口區(qū)域示意圖；(e) 不同治療下大鼠各時間點(diǎn)的傷口閉合率；(f) 第15天傷口區(qū)域的H&E染色；(g) Masson染色，紅色三角形表示新生毛囊，黃色圓圈表示活躍的新生血管化，深色虛線框表示缺陷區(qū)域，左側(cè)為縮小圖像，中間為表皮放大圖（Epi），右側(cè)為真皮放大圖；(h-k) 傷口長度、表皮厚度、膠原蛋白沉積和肉芽組織厚度的量化分析

圖6 Ag?Se@GelMA水凝膠敷料對傷口愈合的體內(nèi)機(jī)制研究。 (a) vWF和VEGF的代表性熒光圖像及(b)量化分析；(c) Nrf2、AMPK和COX IV的代表性熒光圖像及(d)量化分析；(e) TGF-β和IL-10的代表性熒光圖像及(f)量化分析