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安徽中醫(yī)藥大學(xué)郭建團(tuán)隊(duì)針對(duì)牙周炎的臨床治療局限性，開(kāi)發(fā)了一種負(fù)載銀納米顆粒（AgNPs）和槲皮素/咖啡酸苯乙酯脂質(zhì)復(fù)合物（CQ-ML）的智能水凝膠（A/CQ-ML@Gel）。該水凝膠整合了抗菌（AgNPs/殼聚糖）、抗炎（槲皮素調(diào)控PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬以清除ROS）和促骨再生（CAPE增強(qiáng)牙周膜干細(xì)胞成骨分化）功能，通過(guò)程序化釋藥和響應(yīng)性凝膠特性，為牙周炎的綜合治療提供了新的策略和思路。該文章于2025年3月17日以《Chitosan-P407-PNIPAM hydrogel loaded with AgNPs/lipid complex for antibacterial, inflammation regulation and alveolar bone regeneration in periodontitis treatment》為題發(fā)表于《International Journal of Biological Macromolecules》（DOI：10.1016/j.ijbiomac.2025.142080)。

A/CQ-ML@Gel對(duì)牙周炎進(jìn)行三模式治療的示意圖

（1）CQ-ML和AgNP的制備和表征

CQ-ML的粒徑為144.5 ± 0.40 nm，zeta電位為-45.4 ± 0.36 mV，與CAPE-L相近，表明其外層由脂質(zhì)膜包裹（圖1A）。透射電鏡結(jié)果顯示，Qu-MEs呈透明球形，粒徑約30 nm（圖1B），CQ-ML為“小包大”結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）實(shí)驗(yàn)表明，DiO/DiI-ML的FRET比率顯著高于DiI + DiO混合物（P < 0.0001），表明外層脂質(zhì)膜與內(nèi)部微乳間距<10 nm（圖1C）。CQ-ML對(duì)槲皮素和咖啡酸苯乙酯的包封率分別為93.47 ± 0.06%和90.98 ± 0.94%。AgNPs粒徑為45.48 ± 0.208 nm（制備方法未提及）。A/CQ-ML@Gel在37 ℃下表現(xiàn)出快速且穩(wěn)定的溫度敏感性液-固相轉(zhuǎn)變（圖1D）。掃描電鏡（SEM）顯示A/CQ-ML@Gel和CS-P407-PNIPAM內(nèi)部結(jié)構(gòu)為不規(guī)則網(wǎng)狀，孔徑約200 μm，可實(shí)現(xiàn)藥物持續(xù)釋放（圖1E）。流變學(xué)測(cè)試表明，CS-P407-PNIPAM在37 ℃時(shí)粘度最高（圖1F），高粘度有利于藥物在牙周袋內(nèi)滯留和緩慢釋放。A/CQ-ML@Gel保持與CS-P407-PNIPAM相似的剪切稀化性質(zhì)（圖1G），注射時(shí)流動(dòng)性好。儲(chǔ)能模量和損耗模量隨溫度升高而增加，G′始終高于G″，表明A/CQ-ML@Gel可抵抗牙周袋外力（圖1H、圖1I）。CQ-ML呈程序性釋放特征，Qu先釋放，CAPE后釋放，而在A/CQ-ML@Gel中釋放順序相反（圖1J）。A/CQ-ML@Gel具有pH敏感性降解性能，在pH 3.6時(shí)溶解度>90%，在pH 7.4時(shí)溶解度僅為8.03 ± 1.44%（圖1K）。

圖1 CQ-ML和A/CQ-ML@Gel的表征。（a）Qu-ME、CAPE-L和CQ-ML的粒度分布；（b）Qu-ME、CAPE-L和CQ-ML的TEM圖像；（c）DiI + DiO和DiI/DiO-ML的FRET效應(yīng)；（d）25℃和37℃下A/CQ-ML@Gel的外觀；（e）CS-P407、CS-P407-PNIPAM和A/CQ-ML@Gel的SEM圖像；（f）37℃下PNIPAM、CS-P407、CS-P407-PNIPAM的粘度（剪切速率為0.1至100 1/s）；（g）剪切速率為0.1~100 1/s時(shí)，A/CQ-ML@Gel的粘度隨剪切速率的變化；（h）37℃下CS-P407-PNIPAM和CS-P407的儲(chǔ)存模量和損耗模量（G′和G″）隨溫度變化；（i）37℃下A/CQ-ML@Gel的儲(chǔ)存模量和損耗模量（G′和G″）隨溫度變化；（j）Qu和CAPE從CQ-ML或A/CQ-ML@Gel中的體外釋放曲線；（k）A/CQ-ML@Gel在pH 7.4和pH 3.6條件下的質(zhì)量殘留率。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n=8

（2）A/CQ-ML@凝膠的體外抗菌作用

A/CQ-ML@Gel對(duì)牙周炎關(guān)鍵病原體P.g具有體外抗菌作用。掃描電鏡觀察顯示，對(duì)照組P.g表面光滑、形態(tài)規(guī)則，而AgNP組P.g膜出現(xiàn)明顯缺陷和形態(tài)變化（圖2A）。CS-P407-PNIPAM組也觀察到類(lèi)似的細(xì)菌膜破壞，歸因于殼聚糖的抗菌特性。A/CQ-ML@Gel組中P.g膜缺陷和形態(tài)破壞最為顯著，表明其整合了AgNP和殼聚糖的抗菌作用（圖2B）。吸光度檢測(cè)結(jié)果表明，AgNPs、CS-P407-PNIPAM和A/CQ-ML@Gel組的懸液吸光度值均顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明A/CQ-ML@Gel中的AgNPs和CS-P407-PNIPAM組分可抑制P.g增殖?；?死染色結(jié)果表明，Qu-MEs、CAPE-L和CQ-ML對(duì)大腸桿菌無(wú)明顯抑菌作用，但A/CQ-ML@Gel處理的P.g大部分死亡（圖2C）。

圖2 A/CQ-ML@Gel的體外抗菌作用。（a）掃描電鏡觀察P.g形態(tài)特征，白色箭頭示細(xì)菌膜缺陷；（b）不同實(shí)驗(yàn)組治療后P.g的吸光度值，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，*P<0.0001；（c）不同實(shí)驗(yàn)組治療后P.g的活/死染色

（3）巨噬細(xì)胞攝取和巨噬細(xì)胞表型重塑

使用C6熒光標(biāo)記物標(biāo)記納米顆粒以評(píng)估細(xì)胞攝取。C6、C6-ME、C6-L和C6-ML與RAW264.7細(xì)胞共孵育2小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察顯示，C6-ML和C6-L處理的細(xì)胞綠色熒光顯著，C6-ML的細(xì)胞攝取與脂質(zhì)體相似（圖3A）。流式細(xì)胞術(shù)定量結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞對(duì)C6-ML的攝取顯著高于其他組（圖3B）。Qu和CAPE在25 μM濃度下無(wú)明顯細(xì)胞毒性，且CQ-ML對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)顯著細(xì)胞毒性（圖3C）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD86（M1型標(biāo)記物）和CD206（M2型標(biāo)記物），以評(píng)估巨噬細(xì)胞表型。LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型中，Qu-MEs處理的巨噬細(xì)胞CD206/CD86比值高于CAPE-L處理的巨噬細(xì)胞，表明Qu-MEs對(duì)M2表型的調(diào)節(jié)作用更強(qiáng)（圖3D）。

圖3 巨噬細(xì)胞攝取和表型極化研究。（a）C6、C6-ME、C6-L和C6-ML組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光；（b）流式細(xì)胞術(shù)定量經(jīng)C6、C6-ME、C6-L和C6-ML處理的巨噬細(xì)胞熒光，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，**P<0.01，*P<0.0001；（c）不同濃度Qu或CAPE的細(xì)胞活力，以及CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-ME、CQ-ML處理的RAW264.7細(xì)胞（CAPE：25 μM，Qu：4 μM）的細(xì)胞活力，數(shù)據(jù)為平均值±SD，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（d）流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理巨噬細(xì)胞散點(diǎn)圖

（4）CQ-ML調(diào)節(jié)PINK 1/Parkin-ROS級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制炎癥

CQ-ML對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子的抑制作用可能與PINK1/Parkin-ROS信號(hào)通路有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與含槲皮素的制劑相比，CAPE-L處理組PINK1和Parkin表達(dá)水平較低，而CQ-ML處理顯著增加PINK1和Parkin表達(dá)，啟動(dòng)線粒體自噬（圖4A-D）。免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中，CQ-ML表現(xiàn)出最強(qiáng)的ROS生成抑制能力，這歸因于槲皮素促進(jìn)線粒體自噬及脂質(zhì)復(fù)合物的高細(xì)胞攝取率（圖4E-G）。這些結(jié)果表明，CQ-ML通過(guò)調(diào)控PINK1/Parkin-ROS級(jí)聯(lián)，發(fā)揮以槲皮素為主導(dǎo)的線粒體自噬作用，從而抑制炎癥。

圖4 CQ-ML調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中PINK1/Parkin-ROS級(jí)聯(lián)反應(yīng)。（a）免疫熒光檢測(cè)各組線粒體形態(tài)及PINK1和Parkin共定位；（b）ImageJ繪制各組PINK1和Parkin的3D表面圖；（c，d）ImageJ定量PINK1和Parkin相對(duì)熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.0001；（e）各組巨噬細(xì)胞中DCFH-DA熒光表達(dá)；（f）ImageJ定量各組相對(duì)DCFH-DA熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，*P<0.05，*P<0.0001；（g）流式細(xì)胞術(shù)定量各組處理的巨噬細(xì)胞中DCFH-DA熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，*P<0.0001

（5）CQ-ML促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化（體外研究）

 CQ-ML對(duì)牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）成骨分化能力的調(diào)控作用研究結(jié)果顯示，槲皮素（Qu）和咖啡酸苯乙酯（CAPE）濃度低于25 μM時(shí)對(duì)PDLSCs無(wú)明顯細(xì)胞毒性（圖5A），CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-MEs和CQ-ML處理組（CAPE：25 μM，Qu：4 μM）也未觀察到顯著毒性。堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基刺激后ALP陽(yáng)性染色區(qū)域和礦化結(jié)節(jié)形成明顯，而LPS處理的模型組較弱。CQ-ML和CAPE-L處理組均顯示出顯著的ALP陽(yáng)性染色區(qū)域和礦化結(jié)節(jié)形成（圖5B-C）。定量分析表明，CQ-ML和CAPE-L處理組的ALP濃度分別是模型組的1.70倍和1.48倍（圖5D-E）。

圖5 CQ-ML促進(jìn)PDLSCs體外成骨分化。（a）不同濃度Qu或CAPE的細(xì)胞活力，以及CAPE+Qu、CAPE-L+Qu-ME、CQ-ML處理的PDLSCs細(xì)胞活力，數(shù)據(jù)為平均值±SD，*P<0.001，*P<0.0001；（b）各制劑處理的PDLSCs的ALP和茜素紅染色；（c，d）各制劑處理的PDLSCs中ALP或茜素紅的相對(duì)面積，數(shù)據(jù)為平均值±SD，通過(guò)ImageJ定量，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（e）各制劑處理的PDLSCs上清液中ALP濃度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=8，**P<0.01，*P<0.001

（6）A/CQ-ML@Gel在體治療牙周炎的效果及生物安全性評(píng)估

通過(guò)絲線結(jié)扎聯(lián)合LPS注射法建立SD大鼠牙周炎模型（圖6A）。4周治療后，A/CQ-ML@Gel組牙齦出血消失，牙齦組織再生（圖6B-C），牙周袋深度（PD）顯著降低，效果與陽(yáng)性對(duì)照藥派麗奧相當(dāng)（圖6D-E）。H&E染色顯示模型組牙齦乳頭破壞、牙周韌帶結(jié)構(gòu)紊亂，而治療組組織再生良好（圖6F）。Masson染色證實(shí)A/CQ-ML@Gel組膠原表達(dá)最高（圖6G）。

圖6 A/CQ-ML@Gel對(duì)牙周炎的體內(nèi)治療作用。（a）牙周炎模型建立及給藥示意圖；（b-e）各組治療后2周、4周GI或PD值，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6，*P<0.05，**P<0.01，*P<0.001，*P<0.0001；（f）各組牙周組織H&E染色，（g）Masson染色，AB為牙槽骨，PDL為牙周膜

（7）A/CQ-ML@Gel通過(guò)調(diào)控PINK1/Parkin通路抑制牙周炎癥體內(nèi)研究

A/CQ-ML@Gel的體內(nèi)抗炎作用機(jī)制得到驗(yàn)證。免疫熒光檢測(cè)顯示（圖7A-D），模型組因長(zhǎng)期氧化應(yīng)激導(dǎo)致PINK1/Parkin表達(dá)降低，而A/CQ-ML@Gel治療4周后顯著提升PINK1/Parkin表達(dá)，效果優(yōu)于單獨(dú)使用Qu-MEs@Gel或CAPE-L@Gel。免疫組化結(jié)果顯示（圖7E-G），促炎因子IL-6顯著減少，抗炎因子IL-10增加2.3倍。這證實(shí)了A/CQ-ML@Gel通過(guò)ROS-PINK1/Parkin通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。在pDA-mBP@DAT和LIPUS刺激下，膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨均參與了骨修復(fù)過(guò)程（圖7G）。

圖7 A/CQ-ML@Gel促進(jìn)PINK1/Parkin表達(dá)用于體內(nèi)抗炎。（a，b）治療后牙周組織中PINK1和Parkin的表達(dá)；（c-d）PINK1和Parkin在各制劑處理的牙周組織中的相對(duì)強(qiáng)度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，使用ImageJ軟件定量，*P<0.001，*P<0.0001；（e）治療后牙周組織中IL-6和IL-10的免疫組化染色；（f-g）使用ImageJ定量各組牙周組織中IL-6和IL-10的相對(duì)強(qiáng)度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=3，**P<0.01，*P<0.0001。AB為牙槽骨，PDL為牙周膜

（8）A/CQ-ML@Gel促進(jìn)牙槽骨再生

A/CQ-ML@Gel在體內(nèi)促進(jìn)牙槽骨再生的作用得到研究。Micro-CT結(jié)果顯示（圖8A），模型組上頜第一和第二磨牙的黃色間隙大于正常組，表明牙槽骨破壞明顯。A/CQ-ML@Gel和CAPE-L@Gel施用后黃色間隙變小，表明顯著的牙槽骨再生，而Qu-MEs@Gel的修復(fù)作用較弱。進(jìn)一步研究牙周組織中成骨標(biāo)志物OP.G和OPN的表達(dá)（圖8B），模型組OP.G、OPN表達(dá)減少，而A/CQ-ML@Gel可逆轉(zhuǎn)上述變化（圖8C-D）。RANKL-RANK信號(hào)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化，加速牙槽骨破壞，而骨橋蛋白的高表達(dá)表明骨髓源性基質(zhì)細(xì)胞沿成骨途徑分化，與無(wú)膠原骨水泥層的形成相關(guān)，有利于骨生長(zhǎng)。

圖8 A/CQ-ML@Gel促進(jìn)牙槽骨再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。（a）治療后各組大鼠上頜骨顯微CT圖像；（b）免疫組化染色觀察不同制劑對(duì)大鼠牙周組織中OP.G和OPN的影響；（c-d）使用ImageJ定量各制劑處理的大鼠牙周組織中OP.G和OPN的相對(duì)強(qiáng)度，數(shù)據(jù)為平均值±SD，n=3，*P<0.001，*P<0.0001。AB為牙槽骨，PDL為牙周韌帶