團(tuán)隊(duì)最新研究進(jìn)展：負(fù)載淫羊藿苷和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的高強(qiáng)度雙網(wǎng)絡(luò)絲素蛋白水凝膠用于骨修復(fù)
專欄：學(xué)術(shù)前沿
發(fā)布日期：2024-04-30
作者：
骨缺損通常由外傷、疾?。ㄈ绻悄[瘤或骨質(zhì)疏松）、以及先天性缺陷引起，嚴(yán)重骨缺損的治療對(duì)傳統(tǒng)方法如自體骨移植和同種異體骨移植提出了挑戰(zhàn)。這些傳統(tǒng)方法存在種種限制，如供骨來源有限、手術(shù)創(chuàng)傷大、可能的免疫排斥反應(yīng)及疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。基于天然蛋白水凝膠具有高水含量和良好的生物相容性，可以為細(xì)胞提供了一個(gè)支持生長和新組織形成的理想環(huán)境。盡管大部分蛋白質(zhì)及其衍生物構(gòu)建的用于骨缺損修復(fù)的水凝膠能夠滿足促進(jìn)細(xì)胞生長的要求，然而這些水凝膠通常具有較差的機(jī)械性能，難以滿足硬組織修復(fù)的要求。此外，骨組織再生還涉及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。為確保構(gòu)建的水凝膠組織工程支架能夠滿足組織再生的需求，有效遞送干細(xì)胞和其他生物活性分子以促進(jìn)骨再生，也是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。
針對(duì)上述問題，暨南大學(xué)郭瑞課題組聯(lián)合杭州醫(yī)學(xué)院吳剛、林海燕主任團(tuán)隊(duì)，首先對(duì)環(huán)糊精和金剛烷進(jìn)行改性，通過環(huán)糊精和金剛烷的主客體組裝作用制備了三臂交聯(lián)劑HGSM，再利用HGSM與甲基丙烯?；z素蛋白SFMA進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，形成雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠HGSFMA，再利用水凝膠負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和淫羊藿苷（ICA）（圖1）。該研究利用環(huán)糊精和金剛烷的主客體組裝作用，顯著增強(qiáng)了甲基丙烯?；z素蛋白（SFMA）的機(jī)械強(qiáng)度，并且利用該水凝膠遞送骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和淫羊藿苷（ICA），抑制了破骨細(xì)胞的形成，促進(jìn)損傷股骨的再生。該工作以“High-strength double-network silk fibroin based hydrogel loaded with Icariin and BMSCs to inhibit osteoclasts and promote osteogenic differentiation to enhance bone repair”為題發(fā)表在《Biomaterials Advances》（DOI：10.1016/j.bioadv.2024.213856）上。暨南大學(xué)郭瑞研究員、杭州醫(yī)學(xué)院吳剛教授和林海燕教授為該文的通訊作者。
圖1 水凝膠制備過程示意圖
（1）HGSFMA水凝膠具有顯著增強(qiáng)的模量和機(jī)械強(qiáng)度 制備的HGSFMA水凝膠相比于SFMA水凝膠，極大地提高了水凝膠的模量和壓縮強(qiáng)度，模量的提升與HGSM的添加量成正比（圖2）。
圖2 SFMA和HGSFMA 水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的表征。(A) HGSM的2D ROESY NMR譜；(B) SF和SFMA的1 H NMR譜；(C) 水凝膠的SEM圖像；(D)-(E)水凝膠流變檢測；(F) 水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線；(G) 水凝膠的溶脹率和（H）降解率；(I) ICA的體外累積釋放速率曲線。
（2）水凝膠的生物相容性和體外成骨作用評(píng)價(jià) 進(jìn)一步用BMSCs對(duì)ICA的毒性和水凝膠的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，該研究制備的水凝膠無細(xì)胞毒性。并且HGSFMA/ICA水凝膠能夠促進(jìn)BMSCs的堿性磷酸酶ALP的表達(dá)（圖3）。茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和成骨相關(guān)蛋白（RUNX2和OCN）的表達(dá)量也顯著增加（圖4）。
圖3 SFMA和HGSFMA水凝膠對(duì)BMSCs的細(xì)胞毒性以及BMSCs體外誘導(dǎo)分化的ALP染色。（A）不同濃度ICA培養(yǎng)的BMSCs在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)變化；（B）不同濃度ICA培養(yǎng)的BMSCs的細(xì)胞活力；（C）通過CCK-8測定與水凝膠共培養(yǎng)的 BMSC 的細(xì)胞活力；（D）水凝膠培養(yǎng)的BMSC的活/死染色和（E）細(xì)胞骨架染色圖像；（F）水凝膠培養(yǎng)14天后BMSCs的ALP染色；（G）BMSCs的ALP活性的定量檢測。
圖4 培養(yǎng)14天后BMSCs體外成骨評(píng)價(jià)。（A）茜素紅染色；（B）RUNX2和OCN免疫熒光染色圖像；（C）茜素紅染色定量；（D）RUNX2和（E）OCN表達(dá)的定量分析。
（3）大鼠股骨損傷模型治療效果評(píng)價(jià)
通過大鼠股骨損傷模型，驗(yàn)證水凝膠促進(jìn)骨再生的作用。在股骨缺損治療后1-2周，與HGSFMA組和對(duì)照組相比，HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC組表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的骨再生，新形成的骨幾乎填充了腔隙缺損。術(shù)后4周，HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC組顯示出更大的新形成骨質(zhì)量。Micro-CT數(shù)據(jù)的定量分析進(jìn)一步支持了HGSFMA/ICA/BMSC組優(yōu)異的骨再生潛力。該組的骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）/骨礦物質(zhì)密度（BMD）顯著高于其他對(duì)照組，骨小梁厚度（Tb/Th）增加和骨小梁分離（Tb. Sp）減少，證明了HGSFMA/ICA/BMSC水凝膠在促進(jìn)大鼠股骨缺損模型中骨再生和改善骨質(zhì)量方面的有效性（圖5）。
圖5 CT成像評(píng)價(jià)大鼠股骨損傷的治療效果。（A）再生骨組織的顯微CT圖像（白色虛線圓圈代表缺損位置）；（B）骨密度(BMD)定量指標(biāo)；（C）骨體積分?jǐn)?shù)定量指標(biāo)(BV/TV)；（D）小梁數(shù)量定量指標(biāo)(Tb.Th)；（E）骨小梁分離的定量指標(biāo) (Tb. Sp)。
維持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于有效的骨修復(fù)至關(guān)重要。破骨細(xì)胞的持續(xù)存在和升高會(huì)顯著阻礙骨再生的速度。炎癥是驅(qū)動(dòng)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。ICA已被證明可以有效抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放并調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而減輕局部炎癥并抑制破骨細(xì)胞分化。此外，淫羊藿苷通過STAT3途徑促進(jìn)下游成骨基因骨鈣素（OCN）的轉(zhuǎn)錄，其中STAT3直接與OCN啟動(dòng)子相互作用。TRAP染色顯示HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC組內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)量顯著降低（圖6）。
圖6 治療4周后破骨細(xì)胞的染色。 白色箭頭指示破骨細(xì)胞
研究結(jié)論：
該研究報(bào)道了雙網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)高強(qiáng)度水凝膠HGSFMA對(duì)比SFMA具有明顯提升的機(jī)械強(qiáng)度，并且具有優(yōu)異的生物相容性，可以作為載體遞送藥物和干細(xì)胞，是一種良好的骨組織工程支架材料。體外研究結(jié)果表明，HGSFMA/ICA水凝膠具有增強(qiáng)BMSC增殖和分化的能力。大鼠股骨損傷修復(fù)模型治療效果評(píng)價(jià)中，通過micro-CT、病理染色、TRAP染色、關(guān)鍵成骨標(biāo)志物的免疫熒光染色等證實(shí)了HGSFMA/ICA/BMSC在抑制破骨細(xì)胞和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化中的有效性?？傮w來說，該研究結(jié)果對(duì)于啟發(fā)改善天然蛋白機(jī)械性能，構(gòu)建基于天然蛋白的骨組織工程支架具有積極意義。
原文鏈接：
https://www-sciencedirect-com.lille.sjlib.cn/science/article/pii/S2772950824000992
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