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研究背景：

針對上述問題，華東理工大學(xué)張雋佶團(tuán)隊構(gòu)建了一種與血糖（BGL）實時互動的動態(tài)水凝膠敷料，用于解決糖尿病創(chuàng)面微環(huán)境復(fù)雜、血糖波動干擾愈合的難題。該水凝膠以堿性慢性創(chuàng)面環(huán)境為“燃料”，通過pH敏感的席夫堿交聯(lián)和封裝葡萄糖氧化酶（GOx）/過氧化氫酶（CAT），實現(xiàn)“溶膠-凝膠-溶膠”的循環(huán)：創(chuàng)面堿性環(huán)境觸發(fā)水凝膠形成并封閉傷口；GOx消耗局部血糖生成葡萄糖酸，酸化微環(huán)境并切斷席夫堿鍵使凝膠降解，釋放的GOx進(jìn)一步降低血糖；當(dāng)血糖和pH趨于穩(wěn)態(tài)時，凝膠降解和酶釋放自動停止，從而維持創(chuàng)面微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在I型糖尿病小鼠模型中，該自適應(yīng)敷料顯著加速創(chuàng)面愈合，展示了其作為下一代精準(zhǔn)治療材料的潛力。該文章于2025年7月1日以《Microenvironment-feedback regulated hydrogels as living wound healing materials》為題發(fā)表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-60858-3）。

圖1. OSA-GEL@GC 水凝膠的制備及其對糖尿病傷口愈合的影響示意圖

（1）微環(huán)境反饋調(diào)節(jié)水凝膠的設(shè)計與表征

微環(huán)境反饋調(diào)節(jié)水凝膠（OSA-GEL）是通過將氧化鈉藻酸鹽（OSA）與明膠（GEL）混合制備而成的。由于形成了亞胺席夫堿，生成了一種淡黃色凝膠，其特性通過流變學(xué)、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）進(jìn)行表征（圖2 A）。由于亞胺鍵交聯(lián)劑具有pH響應(yīng)性，可在酸性環(huán)境中輕易解離，因此通過流變學(xué)測試檢查了OSA-GEL的pH依賴性力學(xué)性能。該凝膠在高pH值下表現(xiàn)出良好的剛度（G’＝615 Pa，pH 8），而在低pH值下剛度顯著降低（G’＝131 Pa，pH 5；圖 2 B），表明pH值可調(diào)節(jié)水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的交聯(lián)程度。與此同時，設(shè)計了一種催化且受pH反饋驅(qū)動的反應(yīng)，與水凝膠系統(tǒng)耦合，利用葡萄糖氧化酶（GOx）通過消耗葡萄糖生成葡萄糖酸來自主調(diào)節(jié)局部pH值，最終導(dǎo)致水凝膠溶解。Gox 將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，體系pH隨葡萄糖濃度(1–4 g/L)呈梯度下降至4.5–5.5，且GOx量(0.01–0.6 g/L)決定酸化速率（圖2 C 和 D）。

通過在每個循環(huán)結(jié)束時重復(fù)添加堿性葡萄糖緩沖液，實現(xiàn)了三次暫態(tài)形成和解離循環(huán)。堿性燃料補充可觸發(fā)凝膠—溶膠—凝膠三循環(huán)，溶膠段由葡萄糖濃度決定（圖2 E 和 F），為了了解動態(tài)過程中的形態(tài)變化，對第二個循環(huán)的樣品進(jìn)行了掃描電子顯微鏡（SEM）成像，并在不同時間間隔進(jìn)行分析（圖2 G）。通過燃料/反燃料循環(huán)獲得了“膨脹-收縮-膨脹”過程（圖2 H），這與OSA-GEL@G的瞬態(tài)形成和解離過程一致。OSA:GEL=1:2時黏附強度最高達(dá)6.0 kPa，可隨皮膚彎曲、拉伸、扭轉(zhuǎn)保持貼合（圖2 I–K）。動態(tài)溶脹-收縮循環(huán)證實凝膠可逆性，水凝膠模制性能良好，可在不同形狀創(chuàng)面原位成型。

圖2.（A）OSA-GEL水凝膠及其前驅(qū)體OSA與明膠的紅外光譜及凝膠制備示意圖；（B）OSA-GEL@G水凝膠在pH 8與pH 5下的流變特性；（C、D）不同葡萄糖/GOx濃度驅(qū)動的可編程pH變化（n=3）；（E）以堿性緩沖液為燃料的三次溶膠-凝膠循環(huán)流變曲線；（F）燃料-反饋環(huán)路內(nèi)的形成-解離示意圖；（G、H）0.6 g/L GOx與4 g/L葡萄糖體系中不同時間點的SEM圖像（比例尺10 μm）及孔徑分析（n=3）；（I、J、K）水凝膠與皮膚組織的黏附行為示意圖、剪切強度測試以及不同OSA:GEL比例下的黏附力（n=3）及其在小鼠皮膚上隨形變保持黏附的照片（比例尺1 cm）

（2）OSA-GEL@GC 水凝膠的體外生物相容性

為了制備動態(tài)傷口敷料，進(jìn)一步引入過氧化氫酶（CAT）與GOx結(jié)合，OSA-GEL@GC以0.60 g/L GOx與0.08 g/L CAT共封裝，CAT將GOx催化葡萄糖生成的H?O?實時轉(zhuǎn)化為H?O與O?，不僅降低了活性氧（ROS）的毒性，還緩解了糖尿病傷口缺氧的微環(huán)境。為了評估OSA-GEL@GC的生物相容性，體系與HUVECs共培養(yǎng)5 d，活/死染色未見死細(xì)胞增多，CCK-8示細(xì)胞存活率與空白對照一致（圖3 A 和 B）。溶血試驗顯示，PBS陰性對照組和凝膠組未出現(xiàn)顯著顏色變化（＜5%；圖3 C），顯著低于雙蒸水陽性對照，表明OSA-GEL@GC具有良好的血液相容性。3D Transwell實驗24 h后，凝膠組穿過膜細(xì)胞數(shù)與對照無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3 D 和 E）。在劃痕實驗中，2D劃痕實驗24 h后，凝膠組剩余創(chuàng)面面積較對照縮小20%（圖3 F 和 G），表明凝膠甚至能在一定程度上改善細(xì)胞的2D遷移能力。上述結(jié)果進(jìn)一步證實了OSA-GEL@GC良好的生物相容性及其作為傷口敷料的潛力。

DCF 熒光探針檢測顯示，含CAT 組（Group 3）胞內(nèi) ROS 熒光強度顯著低于未加 CAT組（Group 2）（圖3 H 和 I），表明過氧化氫酶組分具有有效的 ROS 清除作用。細(xì)胞內(nèi)O?探針成像及溶氧儀測定表明，Group 3熒光信號弱于Group 2，溶解氧濃度由4.2 mg/L升至7.8 mg/L，而對照組下降至2.1 mg/L（圖3 J 和 K），表明過氧化氫酶組分有效誘導(dǎo)了 O? 生成。這些結(jié)果表明，過氧化氫酶（CAT）能夠?qū)?ROS轉(zhuǎn)化為H2O 和O2，從而緩解糖尿病傷口的缺氧狀態(tài)。

圖3.（A）HUVECs共培養(yǎng)第1、3天活/死染色（標(biāo)尺50 μm）；（B）第1、3、5天細(xì)胞存活率（n=3）；（C）溶血率測試：雙蒸水、PBS、凝膠組（n=3）；（D）Transwell遷移圖像（標(biāo)尺50 μm）；（E）遷移統(tǒng)計（n=3）；（F）劃痕0、12、24 h圖像（標(biāo)尺50 μm）；（G）劃痕遷移定量（n=3）；（H、I）DCFH-DA測胞內(nèi)ROS（標(biāo)尺50 μm，n=5）；（J、K） Ru(dpp)?Cl?測胞內(nèi)O?（標(biāo)尺50 μm，n=5，組1：細(xì)胞；組2：OSA-GEL@G；組3：OSA-GEL@GC）

（3）用于體內(nèi)糖尿病傷口愈合的 OSA-GEL@GC 水凝膠敷料

為了反映燃料反饋設(shè)計對傷口微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響，監(jiān)測了糖尿病小鼠傷口微環(huán)境中的葡萄糖含量、pH值以及水凝膠狀態(tài)。用 OSA-GEL 對照組處理的第 2 組的葡萄糖含量相對較高，在 0.86-1.23 mmol/g 之間。相比之下，用 OSA-GEL@GC 處理的第 3 組的葡萄糖含量在最初的 12 小時內(nèi)從最初的 1.19 mmol/g 急劇下降到 0.60 mmol/g，然后在隨后的 36 小時內(nèi)逐漸下降到約 0.25 mmol/g，并在接下來的 3 天內(nèi)幾乎保持不變，沒有持續(xù)下降，顯示出良好的 BGL 降級和同化作用（圖 4 A）。傷口床的pH值也進(jìn)行了檢測，結(jié)果最終穩(wěn)定在6.5±0.2左右（圖 4 B）。傷口 pH 值呈弱酸性，有利于傷口修復(fù)，這種 “平衡 ”狀態(tài)一直持續(xù)到第 5 天。pH值的平衡可歸因于堿性pH值和生理緩沖液作為調(diào)節(jié)pH值的燃料。而對照組（用 OSA-GEL 處理的第 2 組）的傷口 BGL 和 pH 值在 5 天后仍保持在較高水平，顯示傷口愈合效果相對較差。在 OSA-GEL 敷料組的初始階段，糖尿病傷口的基本微環(huán)境可能會導(dǎo)致測試傷口床的 pH 值（約 7.8）和 BGL 值（1.24 mmol/g）升高，這是糖尿病傷口微環(huán)境的典型特征。BGL（0.99 mmol/g）和pH值（約7.5）在36小時后略有下降，相比之下，OSA-GEL@GC在12小時后顯著下調(diào)了傷口床的pH值（約6.6）和BGL水平（0.60 mmol/g）。上述結(jié)果表明，通過OSA-GEL@GC敷料治療可能改善微環(huán)境，從而促進(jìn)糖尿病傷口愈合。

小鼠的傷口愈合過程（圖4 C 和 D）結(jié)果顯示，第3組（OSA-GEL@GC）的傷口愈合情況優(yōu)于其他糖尿病組（1和2）。第21天背部傷口的示意圖顯示，第3組（OSA-GEL@GC）的傷口愈合加速，因其相對傷口面積僅約4.51%（1.28 mm2）。使用Tegaderm?（第1組）和OSA-GEL（第2組）治療的糖尿病組顯示出有限的愈合效果，分別為7.86 mm2（27.79%，第1組）和4.97 mm2（17.58%，第2組）。供能（基本傷口微環(huán)境）與抗供能（葡萄糖酸）循環(huán)導(dǎo)致OSA-GEL@GC敷料隨時間推移逐漸脫落，從而實現(xiàn)無損傷的敷料更換。HE染色結(jié)果表明使用OSA-GEL@GC（組3）處理的傷口基本愈合，并形成連續(xù)的上皮組織，與正常小鼠對照組組4相似。第3組的平均傷口直徑為1.03毫米，對照組1和2的上皮化水平仍較慢，平均傷口直徑分別為3.15毫米和2.51毫米（圖4 E）。組3的平均組織膠原含量為15.3%（圖4 F），高于組1（7.5%）和組2（12.4%）。Masson三色染色和Sirius紅染色均顯示，OSA-GEL@GC組（組3）和正常小鼠組（組4）的真皮層膠原沉積更密集且排列更規(guī)整，在傷口愈合的成熟階段，I型與III型膠原的比率會增加，Sirius紅染色結(jié)果顯示，組3的I型/III型膠原蛋白比例（1.46）高于組1（1.17）和組2（1.29）（圖4 G 和 H）。這些結(jié)果表明，OSA-GEL@GC敷料可通過加速上皮化水平和膠原蛋白沉積促進(jìn)傷口愈合。

圖4.（A）5 d內(nèi)創(chuàng)面血糖（方塊：OSA-GEL@GC；圓圈：OSA-GEL，n=3）；（B） 對應(yīng)pH值（n=3）；（C）第0、7、14、21天創(chuàng)面照片；（D）第0、7、14、21天相對創(chuàng)面面積（n=3）；（E–G）第21天創(chuàng)面直徑、膠原體積分?jǐn)?shù)、膠原I/III比值（n=3）；（H）第21天H&E（行1-2）、Masson（行3）、Sirius紅（行4）染色圖，標(biāo)尺依次為200、100、100、100 μm

（4）OSA-GEL@GC 水凝膠促進(jìn)傷口愈合的特性分析

管形成實驗測試了OSA-GEL@GC敷料的血管生成促進(jìn)能力。結(jié)果顯示，與對照組相比，OSA-GEL@GC組處理的HUVECs在6小時的時間間隔內(nèi)表現(xiàn)出顯著的管形成能力（圖 5 A-C）。CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)與血管生成的程度呈正相關(guān)。體內(nèi)實驗結(jié)果，第3組在第7天時CD31的陽性面積顯著高于其他糖尿病對照組1和2（圖5 D 和 E），表明OSA-GEL@GC可能對新生血管形成具有促進(jìn)作用。

在傷口愈合的早期階段，真皮中的肌纖維化與傷口愈合的有效性相關(guān)。與組1和組2相比，組3（第7天）中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）陽性細(xì)胞的數(shù)量增加，表明肌成纖維細(xì)胞的面積有所增加（圖5 F 和 G）。肌成纖維細(xì)胞在傷口修復(fù)的早期和晚期階段具有不同的貢獻(xiàn)，在傷口修復(fù)的早期階段，肌成纖維細(xì)胞從成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為合成膠原蛋白并產(chǎn)生增強的收縮力，導(dǎo)致更堅硬的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），能夠抵抗外部壓力，有利于傷口收縮和愈合。而在晚期階段，肌成纖維細(xì)胞的長期存在導(dǎo)致膠原蛋白過度合成，最終導(dǎo)致增生性疤痕形成。肌成纖維細(xì)胞的凋亡可防止過度纖維化并促進(jìn)成熟的瘢痕重塑。第3組在第7天與第1、2組相比，α-SMA陽性肌成纖維細(xì)胞數(shù)量更高，但在第21天則更低。這兩項觀察結(jié)果表明，接受OSA-GEL@GC治療的第3組在傷口愈合過程中進(jìn)展更快，優(yōu)于第1組和第2組。這明確證明了OSA-GEL@GC凝膠敷料在促進(jìn)傷口血管生成和早期收縮方面具有更優(yōu)越的能力。

圖5.（A）HUVECs管腔形成圖（標(biāo)尺50 μm）；（B、C）節(jié)點數(shù)及總分支長度統(tǒng)計（n=5）；（D）第7天CD31染色圖（標(biāo)尺100 μm）；（E）CD31陽性面積百分比（n=5）；（F）第7天α-SMA染色圖（標(biāo)尺100 μm）；（G）α-SMA陽性細(xì)胞計數(shù)（n=5）

（5）OSA-GEL@GC水凝膠對傷口愈合的炎癥分析

通過清除活性氧（ROS）改善炎癥微環(huán)境，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)變，有助于促進(jìn)有效的傷口愈合。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，高葡萄糖DMEM顯著促進(jìn)了M1極化（凝膠組CD86陽性率為12.13%，對照組為17.92%）。而CD163陽性率（M2轉(zhuǎn)化的標(biāo)志）在凝膠組（5.27%）高于對照組（3.10%），表明OSA-GEL@GC可能具有減輕炎癥的活性作用。ROS熒光染色結(jié)果顯示ROS水平從第一組到第四組呈下降趨勢（圖6 A）。M1（CD86陽性細(xì)胞）和M2（CD163陽性細(xì)胞）巨噬細(xì)胞的免疫熒光共染色結(jié)果顯示，組3（OSA-GEL@GC）中向M1極化的程度顯著降低，而組1和2中該比例仍保持在較高水平（圖6 B）。傷口組織中促炎因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（Tnf）在第1組中的表達(dá)水平最高，而在其他組中保持在低水平。此外，抗炎因子IL-10在第3組中的表達(dá)水平略高于第1組和第2組（圖6 C-E）。這些結(jié)果表明，OSA-GEL@GC能有效減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生并抑制巨噬細(xì)胞向M1表型極化，從而抑制炎癥反應(yīng)并加速愈合過程。

圖6.（A）第7天ROS染色圖像（標(biāo)尺100 μm）及熒光強度統(tǒng)計（n=5）；（B）第7天M1（CD86?）/M2（CD163?）共染圖像（標(biāo)尺100 μm）及M1/(M1+M2)比值（n=5）；（C–E）四組創(chuàng)面IL-6、Tnf、IL-10 mRNA表達(dá)（n=3）

（6）OSA-GEL@GC水凝膠處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的RNA測序分析

高葡萄糖DMEM組（對照組）與OSA-GEL@GC組的轉(zhuǎn)錄組譜通過差異表達(dá)分析、基因本體論（GO）富集分析及基因集富集分析（GSEA）進(jìn)行分析。兩組間的轉(zhuǎn)錄差異通過主成分分析（PCA）得以揭示（圖7 A）。火山圖展示了兩組間差異表達(dá)基因（DEGs）的分布，其中包含65個上調(diào)基因和40個下調(diào)基因（圖7 B）。在Venn圖中，OSA-GEL@GC組與對照組相比具有180個獨特基因（圖7 C）。熱圖展示了兩組間105個DEGs的表達(dá)譜（圖7 D）。差異表達(dá)基因的主要生物學(xué)過程與血管重塑相關(guān)，表明浸潤DMEM的凝膠對HUVEC管形成有益（圖7E和F）。通過GSEA分析相關(guān)信號通路，與腎小球血管發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因在OSA-GEL@GC組中顯著上調(diào)（圖7 G）。在差異表達(dá)基因中，多個與促進(jìn)HUVEC管形成相關(guān)的基因在OSA-GEL@GC組中顯著上調(diào)（圖6 H）。OSA-GEL@GC組中Activin A受體2B 型（ACVR2B）的上調(diào)可激活下游Smad2/3通路，從而促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成。CD177與作為血管內(nèi)皮細(xì)胞表面CD31的異源體蛋白酶3（PR3）結(jié)合，可誘導(dǎo)HUVECs中血紅素氧合酶-1的表達(dá)并促進(jìn)抗氧化細(xì)胞反應(yīng)。OSA-GEL@GC組中血小板衍生生長因子受體β的上調(diào)表明內(nèi)皮細(xì)胞對血小板衍生生長因子的敏感性增加，這有利于血管生成。內(nèi)皮細(xì)胞中的Notch配體Jagged1被識別為血管形成的關(guān)鍵因素。微RNA-221的高表達(dá)可上調(diào)AKT/eNOS通路并抑制內(nèi)皮細(xì)胞中homeodomain相互作用蛋白激酶2的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成。因此，上述OSA-GEL@GC組中顯著表達(dá)的基因有助于新生血管的形成，并積極促進(jìn)傷口愈合。

圖7.（A）對照與OSA-GEL@GC組基因表達(dá)PCA圖；（B）DEG火山圖（DESeq2，Wald雙側(cè)）；（C）DEG數(shù)量Venn圖；（D）DEG熱圖；（E、F）GO富集：血管重塑主導(dǎo)（ClusterProfiler，單側(cè)BH校正）；（G） GSEA富集腎小球血管發(fā)育通路；（H）上調(diào)基因關(guān)聯(lián)管腔形成與血管生成