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針對上述問題，東華大學(xué)吳晶磊教授團(tuán)隊構(gòu)建了一種可在原位快速成膠的氧化葡聚糖（ODA）-殼聚糖-布洛芬（CS-IBU）復(fù)合生物黏附水凝膠，用于肝切除后即時止血與抗炎。作者利用ODA醛基與CS-IBU氨基間的席夫堿反應(yīng)，使水凝膠在創(chuàng)面瞬間凝膠化并牢固黏附組織；凝膠持續(xù)釋放的布洛芬營造免疫調(diào)節(jié)微環(huán)境，促進(jìn)肝臟再生。研究系統(tǒng)表征了該水凝膠的理化性質(zhì)與生物相容性，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其抗炎功效，并在大鼠部分肝切除模型中評價其止血性能和免疫調(diào)控能力。該文章于2025年1月14日以《Chitosan-based immunomodulatory bioadhesive hydrogel promotes liver hemostasis and repair》為題發(fā)表于《Carbohydrate Polymers》（DOI：10.1016/j.carbpol.2025.123268）。

研究示意圖

（1）ODA/CS-IBU和ODA/CS生物粘附水凝膠的理化性質(zhì)

CS-IBU的化學(xué)組成通過FTIR分析（圖1A）。殼聚糖和IBU表現(xiàn)出典型的吸收峰，CS-IBU結(jié)合物的FTIR譜圖顯示1627 cm^-1和1521 cm^-1的吸收峰，表明通過酰胺鍵形成了氨基I和氨基II鍵。ODA/CS-IBU水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過FTIR確認(rèn)（圖1B），新形成的席夫堿（–C––N–）峰出現(xiàn)在1644 cm^-1，表明水凝膠網(wǎng)絡(luò)的成功形成?；旌虾螅琌DA和CS-IBU溶液迅速凝膠化（圖1C）。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示兩種水凝膠具有均勻的多孔結(jié)構(gòu)，ODA/CS和ODA/CS-IBU水凝膠的平均孔徑分別為159 ± 21 μm和121 ± 10 μm（圖1D，1E）。流變學(xué)測試（圖1F）顯示，兩種水凝膠的粘度隨剪切速率增加而降低，表現(xiàn)出典型的粘度減薄現(xiàn)象，這與交聯(lián)度相關(guān)。隨著剪切速率增加，水凝膠的粘度趨于一致，可能由于席夫堿鍵的破壞。水凝膠的膨脹比率在6小時內(nèi)達(dá)到平衡（圖1G），ODA/CS和ODA/CS-IBU水凝膠分別為17.8 ± 3%和15.5 ± 2%。凍干后的吸水性測試（圖1H）顯示，10小時后的最大吸水率約為1500%。水凝膠在生理鹽水中的降解率（圖1I）在第14天降解約60%，42天后，ODA/CS-IBU降解76%，ODA/CS降解91%。IBU的累積釋放測試（圖1J）表明ODA/CS-IBU水凝膠可持續(xù)釋放，支持抗炎作用，但第35天時水凝膠部分降解，可能影響紫外吸收結(jié)果。應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖1K）顯示ODA/CS-IBU與ODA/CS水凝膠初期應(yīng)力與應(yīng)變呈線性關(guān)系（圖1L、M、N）。兩者在斷裂應(yīng)變、壓縮強(qiáng)度和壓縮模量上無顯著差異（p > 0.05）。晶紫染色的水凝膠注入豬肝缺損部位（圖1O），SEM圖像顯示水凝膠與肝組織緊密結(jié)合（圖1P）。單軸拉伸測試結(jié)果（圖1Q）表明，ODA/CS-IBU和ODA/CS水凝膠均具有優(yōu)異的粘附強(qiáng)度，ODA/CS-IBU水凝膠的最大粘附應(yīng)力為0.66 ± 0.17 N/cm²（圖1R）。

圖1. CS-IBU（A）和ODA/CS-IBU（B）的FTIR光譜。ODA和CS-IBU溶液以及ODA/CS-IBU生物粘附水凝膠的宏觀照片（C）。SEM圖像（D）、孔徑（E）、流變學(xué)分析（F）、溶脹比（G）、水溶液比（H）、生物粘附性水凝膠的體外降解（I）. IBU從ODA/CS-IBU生物粘附性水凝膠的體外釋放曲線（J）.典型的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線（K）與斷裂應(yīng)變（L），生物粘附性水凝膠的峰值壓縮強(qiáng)度（M）和壓縮模量（N）。用ODA/CS-IBU水凝膠填充的肝臟缺損的大體外觀（O）。肝臟-生物粘附性水凝膠界面的SEM圖像（P）用豬皮測試的生物粘附性水凝膠的結(jié)合強(qiáng)度（Q和R）

（2）抗菌活性

ODA對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)化存活率分別為47 ± 12 %與36 ± 6 %（圖2A-C）；水凝膠及其組分對大腸桿菌殺菌率>90 %，對金黃色葡萄球菌殺菌率>99 %，均顯著高于空白對照（圖2B、C）。

圖2.（A）代表性的細(xì)菌菌落圖像；（B）大腸桿菌和（C）金黃色葡萄球菌接受各種處理的標(biāo)準(zhǔn)化存活率

（3）細(xì)胞相容性

二維（圖3A）和三維（圖3D）評估結(jié)果顯示，ODA/CS和ODA/CS-IBU生物粘附水凝膠中大多數(shù)細(xì)胞為活細(xì)胞（綠色染色），少數(shù)為死細(xì)胞（紅色染色），表明其具有良好的細(xì)胞相容性。所有水凝膠組的成纖維細(xì)胞活性均超過80%（圖3B和E）。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)評估的細(xì)胞增殖顯示，二維培養(yǎng)中第1到第3天增殖迅速，第3到第5天增殖速度減慢（圖3C）。相比之下，三維培養(yǎng)中植入細(xì)胞在第1至第5天增殖趨勢一致（圖3F）。

圖3. 水凝膠的細(xì)胞相容性評估L929成纖維細(xì)胞在表面（A、B、C）上和包封在生物粘附性水凝膠（D、E、F）內(nèi)均顯示出良好的活力，其中活細(xì)胞占優(yōu)勢（綠色染色）和少量死細(xì)胞（紅色染色）

（4）抗炎和抗氧化能力

RT-PCR分析顯示，ODA/CS-IBU生物粘附水凝膠處理的細(xì)胞中，TNF-α和IFN-γ的表達(dá)顯著下調(diào)（圖4A和B），而IL-10的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4C）。流式細(xì)胞術(shù)分析（圖4D）顯示，ODA/CS-IBU組的M2/M1比率顯著高于ODA/CS組（0.51 ± 0.02對比0.40 ± 0.03）（圖4E）。此外，ODA/CS-IBU生物粘附水凝膠顯著降低了內(nèi)源性自由基一氧化氮（NO）水平，從而減輕了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷（圖4F）。通過DCFH-DA染色評估處理組巨噬細(xì)胞的ROS清除能力，結(jié)果表明，ODA/CS-IBU組的綠色熒光信號顯著低于LPS+組，接近LPS-組（圖4H）。流式細(xì)胞術(shù)定量數(shù)據(jù)（圖4G）顯示，ODA/CS-IBU組的DCFH陽性通道百分比（51.7 ± 0.4%）顯著低于ODA/CS組（69.2 ± 0.5%）和陽性對照組（100 ± 0.6%）。

圖4.RT-PCR分析表明，ODA/CS-IBU下調(diào)TNF-α（A）和IFN-γ（B）的表達(dá)，并上調(diào)抗炎基因IL-10的表達(dá)（C）流式細(xì)胞術(shù)（D）表明，ODA/CS-IBU顯著促進(jìn)M2極化（E），降低LPS刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞的NO（F）和ROS（G）的產(chǎn)生。DCFH染色進(jìn)一步證實(shí)了ODA/CS-IBU組中較低的ROS產(chǎn)生（H）

（5）體內(nèi)止血能力

使用大鼠肝臟部分切除模型進(jìn)行體內(nèi)止血能力評估。ODA/CS-IBU和CS-IBU生物粘附水凝膠均顯示在數(shù)秒內(nèi)快速止血（圖5A）.失血量的定量，如濾紙重量增加所證明的，表明與空白對照組（0.66 ± 0.17 g）相比，ODA/CS-IBU（0.13 ± 0.06 g）和ODA/CS（0.17 ± 0.05 g）組的失血量顯著減少（圖5C）。

圖5.（A）大鼠部分肝切除模型示意圖；接受不同止血處理的動物的出血（B）和失血量（C）的宏觀圖像

（6）HE和Masson染色用于評估各組肝臟再生過程中的炎癥情況

圖6A顯示了大鼠部分肝切除模型在第7天和第28天的H&E染色結(jié)果。第7天，ODA/CS-IBU組的纖維囊厚度（133 ± 21 μm）顯著低于ODA/CS組（168 ± 29 μm）和空白對照組（230 ± 33 μm），第28天ODA/CS-IBU組的纖維囊厚度（122 ± 11 μm）繼續(xù)低于其他兩組（圖6C）。 第7天，ODA/CS-IBU組的炎癥細(xì)胞密度為（2.9 ± 0.2 × 103 cells/mm2），顯著低于ODA/CS組（4.6 ± 0.4 × 103 cells/mm2）和空白對照組（5.0 ± 0.6 × 103 cells/mm2）。第28天，ODA/CS-IBU組的炎癥細(xì)胞密度為（2.7 ± 0.3 × 103 cells/mm2），低于ODA/CS組（3.4 ± 0.3 × 103 cells/mm2）和空白對照組（4.2 ± 0.1 × 103 cells/mm2）（圖6D）。第7天，ODA/CS-IBU組纖維囊中的炎癥細(xì)胞密度（3.3 ± 0.2 × 103 cells/mm2）顯著低于空白對照組（4.7 ± 0.1 × 103 cells/mm2），第28天ODA/CS-IBU組炎癥細(xì)胞密度（3.1 ± 0.2 × 103 cells/mm2）顯著低于ODA/CS組（3.9 ± 0.1 × 103 cells/mm2）和空白對照組（4.3 ± 0.2 × 103 cells/mm2）（圖6E）。這些結(jié)果表明，ODA/CS-IBU生物粘附水凝膠顯著減輕了炎癥反應(yīng)。馬松三色染色顯示，與第7天相比，第28天所有組別的新肝組織增加，ODA/CS-IBU組的膠原沉積增強(qiáng)（圖6B）。第28天，ODA/CS-IBU和ODA/CS水凝膠仍有殘留（圖6A和B）。組織學(xué)檢查顯示，實(shí)驗(yàn)組的大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟與空白對照組無顯著差異，未見明顯病變（圖S1）。

圖6.H&E染色（A）和Masson三色染色（B）顯示，與ODA-CS生物粘附水凝膠相比，ODA-CS-IBU生物粘附水凝膠能夠減輕炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為更薄的纖維囊（C），以及生物粘附水凝膠（D）和纖維囊（E）中炎癥細(xì)胞密度顯著降低。H&E染色中殘留的生物粘附水凝膠用三角形標(biāo)記

（7）免疫組化染色用于評估各組肝臟再生過程中的炎癥情況

與ODA/CS和空白對照組相比，ODA/CS-IBU組CD11b（一種促炎性巨噬細(xì)胞標(biāo)記物）的表達(dá)降低（圖7B）。同時，ODA/CS-IBU組CD206+細(xì)胞的密度顯著上調(diào)，表明抗炎性增強(qiáng)（圖7C）。Ki-67（增殖指標(biāo)）的定量分析顯示，ODA/CS-IBU組的增殖率高于ODA/CS和空白對照組，提示肝細(xì)胞增殖加速（圖7D）。

圖7.（A）7天和28天再生肝臟的CD11b+、CD206+和Ki-67+免疫組化染色。從免疫組化圖像中定量分析CD11b（B）、CD206（C）和Ki-67（D）的陽性細(xì)胞密度

（8）再生肝組織的血管化水平評估

血管內(nèi)皮細(xì)胞（CD31+）和血管平滑肌細(xì)胞（α-SMA+）的免疫熒光分析用于評估再生肝組織的血管化水平（圖8A）。第7天，ODA/CS（4.9 ± 0.7%）和ODA/CS-IBU（5.6 ± 1.0%）組的CD31+細(xì)胞比例顯著高于空白對照組（3.2 ± 0.5%）。第28天，ODA/CS-IBU組的CD31+細(xì)胞比例（10.3 ± 2.2%）顯著高于ODA/CS（6.7 ± 2.5%）和空白對照組（5.9 ± 1.8%）（圖8B）。對于α-SMA水平，第7天，空白對照組為6.0 ± 1.1%，ODA/CS組為11.9 ± 3.4%，ODA/CS-IBU組為21.5 ± 4.9%。第28天，空白對照組（8.7 ± 2.6%）和ODA/CS組（11.3 ± 3.6%）保持穩(wěn)定，而ODA/CS-IBU組的α-SMA水平顯著升高至22.5 ± 5.5%（圖8C）。

圖8.（A）免疫熒光染色顯示在第7天和第28天再生組織中的血管形成。CD 31+（B）和α-SMA+（C）細(xì)胞密度的定量