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研究背景：

     針對上述問題，中國藥科大學涂家生教授、姜雷副教授和南京大學蔣錫群教授團隊構(gòu)建了一種“二聚銅肽-ROS響應(yīng)水凝膠”一體化敷料（G/D-CuP）：通過將二聚銅肽（D-CuP）載入可清除ROS并隨ROS濃度智能釋藥的凝膠基質(zhì)，實現(xiàn)了“一劑多靶”——同步抗炎、抗氧化、促血管新生和促成纖維細胞遷移，二聚結(jié)構(gòu)利用空間位阻顯著提升肽酶穩(wěn)定性，凝膠柔軟可形變，能貼合任意創(chuàng)面，且制備簡便、成本低，具備可觀的臨床轉(zhuǎn)化潛力。該文章于2025年7月1日以《Dimeric copper peptide incorporated hydrogel for promoting diabetic wound healing》為題發(fā)表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-61141-1）。

整合二聚銅肽的水凝膠（G/D-CuP）促進糖尿病創(chuàng)面愈合效率。a. G/D-CuP的制備示意圖；b. G/D-CuP在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中的作用

（1）D-CuP的制備與表征

通過賴氨酸橋聯(lián)兩分子GHK三肽合成了二聚肽D-P（圖1a），其結(jié)構(gòu)經(jīng)¹H NMR、¹³C NMR及HRMS確認。D-P與Cu²⁺以1:0.5摩爾比絡(luò)合得到藍紫色D-CuP，UV-Vis在584 nm處出現(xiàn)明顯吸收峰（圖1b），與單體銅肽M-CuP的峰位一致，但在相同配位基團摩爾濃度下吸光度顯著高于M-CuP，表明D-P具有更高的配位效率與穩(wěn)定性（圖1c、d）。EPR在約3426 mT處檢測到Cu²⁺特征信號，進一步證實D-CuP生成（圖1e）。在模擬皮膚生理（pH 4-6）及慢性創(chuàng)面堿性（pH 7-9）環(huán)境中，584 nm吸收峰保持穩(wěn)定，說明D-CuP在pH 4-9范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)完整。以廣譜蛋白酶K進行的體外降解實驗顯示，0.5 h后M-CuP剩余58%，4 h后降至50%；而D-CuP在相同時間點分別剩余92%和87%，證明二聚結(jié)構(gòu)顯著提高了抗酶解穩(wěn)定性（圖1f）。

圖1. D-CuP的制備與表征。a. D-CuP結(jié)構(gòu)式；b. D-CuP溶液顏色；c、d. D-CuP的紫外-可見吸收光譜；e. D-CuP的電子順磁共振譜；f. M-CuP與D-CuP經(jīng)蛋白酶K處理的穩(wěn)定性曲線

（2）G/D-CuP的制備與表征

圖2a所示，EBPBA與PVA經(jīng)苯硼酸酯鍵交聯(lián)，并在室溫下與D-CuP共混5 s即得G/D-CuP水凝膠。SEM顯示水凝膠內(nèi)部為三維互通多孔網(wǎng)絡(luò)，孔徑約50-100 μm（圖2b）。動態(tài)流變測試表明，在0.1%–1200%振蕩應(yīng)變及0.1–500 rad·s^-1角頻率范圍內(nèi)，儲能模量G’始終保持在2500 Pa左右并高于損耗模量G’’，證實其彈性固體特性（圖2c、d）。連續(xù)階躍應(yīng)變實驗顯示，當應(yīng)變由0.1%驟升至1200%時G’由2500 Pa降至390 Pa，應(yīng)變恢復(fù)后G’瞬時回升至2500 Pa（圖2e）；宏觀切片實驗進一步驗證，水凝膠在被切斷后5 s內(nèi)斷面完全愈合，可承受180°彎折而不產(chǎn)生裂紋（圖2f）。在星形及不規(guī)則創(chuàng)面上，G/D-CuP可在10 s內(nèi)完全鋪展并填充所有縫隙，粘附強度達12 kPa，有效封閉創(chuàng)面（圖2g）。體外ROS響應(yīng)釋放實驗表明，在1 mM H₂O₂刺激下，D-CuP在72 h內(nèi)累積釋放90%（圖2h）。

圖2. G/D-CuP的制備與表征。a. G/D-CuP的制備流程；b. G/D-CuP的典型SEM圖像；c. G/D-CuP的流變學—應(yīng)變掃描；d. G/D-CuP的流變學—頻率掃描；e. G/D-CuP的連續(xù)階躍應(yīng)變測試；f. G/D-CuP的自修復(fù)性能；g. G/D-CuP的形變與貼合能力；h. G/D-CuP在PBS與H2O2條件下的累積釋放曲線

（3）G/D-CuP的體外抗炎效應(yīng)與抗氧化能力

在LPS/IFN-γ誘導的RAW 264.7炎癥模型中，G/D-CuP處理使CD86⁺ M1巨噬細胞比例由78.9%降至36.4%，同時CD206? M2群體由3.1%升至12.2%，極化效果顯著優(yōu)于M-CuP（圖 3a–d）。炎癥因子水平同步下降：TNF-α由320 pg·mL^-1降至95 pg·mL^-1，IL-6由410 pg·mL^-1降至120 pg·mL^-1（圖 3e、f）。ROS清除方面，F(xiàn)enton體系中G/D-CuP對羥自由基的清除率超過95%；胞內(nèi)DCFH-DA熒光檢測顯示，H₂O₂刺激下G/D-CuP組ROS熒光強度較陰性對照下降71%，且SOD活性較G/M-CuP組提高1.8倍（圖 3g、h）。血液相容性實驗進一步表明，G/D-CuP的溶血率低于5%，符合生物材料安全要求（圖 3i）。

圖3. G/D-CuP的體外抗炎效應(yīng)與抗氧化能力。a. 不同處理后巨噬細胞表型的代表性熒光圖；b. 不同處理后RAW 264.7細胞CD206與CD86表達的流式細胞術(shù)分析；c. M1（CD86⁺、CD206^-）表型巨噬細胞統(tǒng)計；d. M2（CD206⁺、CD86^-）表型巨噬細胞統(tǒng)計；e. TNF-α與f. IL-6 濃度由ELISA測定；g. G/D-CuP處理后NIH-3T3細胞的ROS熒光圖像；h. G/D-CuP處理后NIH-3T3細胞的SOD活性檢測；i. G/D-CuP的溶血率

（4）G/D-CuP體外促進細胞增殖、遷移及血管生成作用

在圖4a、b所示的Ki67免疫熒光及定量分析中，G/D-CuP使HUVEC增殖率升至69%，顯著高于所有對照；圖4c的MTT結(jié)果顯示，D-CuP在低濃度下對NIH/3T3的促增殖活性優(yōu)于M-CuP，且G、D-CuP、G/D-CuP三組的細胞存活率均保持在90%以上，未見細胞毒性。進一步地，圖4d、e的管腔形成實驗顯示，G/D-CuP組的管腔總長度及網(wǎng)格數(shù)均顯著高于其余處理組；圖4f的VEGF ELISA結(jié)果同樣提示其促血管生成能力顯著增強。遷移能力方面，圖4g、h的Transwell實驗表明G/D-CuP顯著促進成纖維細胞遷移；圖4i、j的劃痕實驗亦顯示D-CuP在30 h內(nèi)使L929細胞劃痕閉合率高于M-CuP，提示二聚銅肽因穩(wěn)定性及活性提升而加速創(chuàng)面修復(fù)。

圖4. G/D-CuP的體外促細胞增殖、遷移與血管生成作用。a. HUVEC細胞經(jīng)不同處理后Ki67免疫熒光代表性圖像；b. Ki67⁺細胞定量分析；c. NIH/3T3細胞與D-CuP或M-CuP共培養(yǎng)24 h后的相對細胞活力；d. 經(jīng)calcein-AM染色（綠色）的HUVEC細胞管腔形成實驗代表性圖像；e. 總管長定量分析；f. ELISA測定VEGF濃度；g. L929細胞Transwell遷移實驗代表性圖像；h. 遷移細胞數(shù)定量分析；i. L929 細胞劃痕實驗不同時間點圖像；j. 劃痕愈合率隨時間變化

（5）D-CuP治療作用的蛋白質(zhì)組學分析

圖5a所示流程下，對L929纖維肉瘤細胞行定量蛋白質(zhì)組學檢測；圖5b的PCA圖顯示D-CuP組與PBS組蛋白表達譜明顯分離。差異蛋白火山圖（圖5c）共篩得74個DEP（29個上調(diào)、45個下調(diào)，p<0.05，|FC|>1.2）。按愈合三階段分類，炎癥與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Cop1、H2-D1、Ndufa6、Fam76a顯著下調(diào)，增殖、遷移及血管生成相關(guān)蛋白Slc38a2、Psph、Jagn1、Rorb顯著上調(diào)（圖5d）。GO富集（圖5e）揭示分子功能調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運活性、細胞膜組分、細胞過程與生物調(diào)控為主要條目；KEGG通路（圖5f）則聚焦核苷酸切除修復(fù)、p53、mTOR、IL-17、NOD樣受體及HIF-1信號軸。分子對接（圖5g）給出D-CuP對p53 DNA結(jié)合域和HDAC7催化域的結(jié)合能分別為-5.7 kcal·mol^-1與-6.4 kcal·mol-¹，顯著優(yōu)于M-CuP的-4.2 kcal·mol^-1與-4.8 kcal·mol^-1。SPR動力學（圖5h）進一步測定D-CuP與p53、HDAC7的平衡解離常數(shù)KD分別為3.8×10^-6 M和1.81×10^-6 M，而M-CuP在各濃度下響應(yīng)均<5 RU，證實二聚結(jié)構(gòu)通過多價協(xié)同增強靶點結(jié)合。

圖5. D-CuP干預(yù)前后L929細胞的蛋白質(zhì)組學評估。a. 蛋白質(zhì)組學分析流程示意圖；b. 基于兩組L929細胞差異表達蛋白的PCA主成分分析；c. D-CuP處理后上調(diào)與下調(diào)基因的火山圖；d. 差異蛋白熱圖；e. D-CuP組與對照組差異蛋白的GO功能分析；f. D-CuP組與對照組差異蛋白的KEGG通路富集；g. p53與M-CuP、p53與D-CuP、HDAC7與M-CuP、HDAC7與D-CuP分子對接示意圖；h. SPR測定M-CuP與D-CuP對p53或HDAC7的結(jié)合親和力

（6）G/D-CuP促進糖尿病創(chuàng)面愈合的效果

圖6a所示體內(nèi)實驗將糖尿病小鼠創(chuàng)面隨機分為PBS（NC）、G、M-CuP、D-CuP、G/M-CuP及G/D-CuP六組，并以健康鼠PBS處理作為空白對照（BC）。圖6b、c的宏觀照片記錄顯示，第3天起各治療組創(chuàng)面面積已明顯小于NC；第7天G/D-CuP組剩余面積僅17.3%，優(yōu)于其余各組（圖6d）。到第12天，NC與M-CuP組仍分別殘留34.2%與17.8%創(chuàng)面，D-CuP組降至9.8%，而G/D-CuP組僅余2.8%。組織學層面，圖6e的H&E染色表明，第7天G/D-CuP組已形成致密肉芽組織，第12天完成表皮覆蓋并可見大量新生毛囊與皮脂腺；圖6f定量顯示其肉芽厚度顯著高于其他組，提示G/D-CuP在加速糖尿病創(chuàng)面閉合、促進皮膚附件再生及提升愈合質(zhì)量方面具有最顯著優(yōu)勢。

圖6. G/D-CuP促進糖尿病創(chuàng)面愈合的效果。a. 各組動物實驗時間軸示意圖；b. 不同處理組創(chuàng)面代表性照片；c. 第0、3、7、12天各組創(chuàng)面愈合情況對比；d. 12天內(nèi)創(chuàng)面愈合率；e. 第12天各處理組創(chuàng)面組織H&E染色；f. 第12天各組肉芽組織厚度

圖7a、b的第3天ELISA結(jié)果顯示，G/D-CuP組創(chuàng)面IL-6水平最低、IL-10最高，提示炎癥期提前結(jié)束；圖7c的第7天組織染色進一步驗證TNF-α與IL-6下調(diào)、IL-10上調(diào)。進入增殖期，圖7d的第3天VEGF ELISA及圖7c、e的第7天免疫組化表明，G/D-CuP組VEGF與CD31表達均最高，CD31平均光密度比G/M-CuP組提高1.48倍；第12天該組新生血管數(shù)量已顯著減少，顯示血管生成被適時終止，重塑期提前啟動。圖7c、f的Ki67染色顯示，G/D-CuP組第7天細胞增殖信號最強，第14天迅速回落；Masson三色（圖7g）表明其膠原密度、厚度及排列方向均優(yōu)于G/M-CuP組，接近健康皮膚結(jié)構(gòu)。

圖7. G/D-CuP加速糖尿病創(chuàng)面三期修復(fù)。ELISA測定第3天創(chuàng)面 a. IL-6、b. IL-10、d. VEGF濃度；c. 第7天TNF-α、VEGF、CD31、Ki67免疫組化代表性圖像及第12天Masson染色代表性圖像；e. 第7天CD31、f. Ki67免疫組化定量分析；g 第12天各組膠原沉積定量