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針對(duì)上述問(wèn)題，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院劉繼勇團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種雙載荷仿生納米遞送系統(tǒng)TP-siRC@tHyNPs，該系統(tǒng)以肺轉(zhuǎn)移灶高表達(dá)的CYP3A4為靶點(diǎn)，先用特異性siRNA沉默該代謝酶以顯著延長(zhǎng)雷公藤甲素（TP）半衰期；再用外泌體-陽(yáng)離子脂質(zhì)體雜化膜（tHyNPs）共包載TP與CYP3A4-siRNA以克服裸siRNA易降解、脂質(zhì)體毒性大及外泌體載藥低的缺陷。另外，該納米粒表面修飾了DR5單鏈抗體（scFv），可精準(zhǔn)識(shí)別腫瘤細(xì)胞高表達(dá)而正常組織幾乎缺如的DR5受體，觸發(fā)死亡受體凋亡通路并增強(qiáng)靶向滲透。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)了其理化性質(zhì)、細(xì)胞攝取、代謝譜、抗腫瘤活性及生物安全性，證實(shí)該多功能平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)藥物-基因協(xié)同、精準(zhǔn)遞送與低毒高效治療PMM的臨床潛能。該文章于2025年7月25日以《Engineering hybrid nanoparticles for targeted codelivery of triptolide and CYP3A4- siRNA against pulmonary metastatic melanoma》為題發(fā)表于《Science Advances》上（DOI: 10.1126/sciadv.adv6990）。

研究示意圖

（1）DR5-scFv的構(gòu)建與抗腫瘤效應(yīng)表征

為獲得全長(zhǎng)人源DR5-scFv，實(shí)驗(yàn)經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞表達(dá)獲得。圖2A、2D的分子對(duì)接結(jié)果顯示其與DR5蛋白結(jié)合常數(shù)KD=7×10?? M；圖2B~C的CBB染色及WB結(jié)果證實(shí)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后DR5-scFv蛋白表達(dá)；圖2E~F中穩(wěn)轉(zhuǎn)293T-DR5-scFv細(xì)胞的RT-qPCR、CBB染色、AGE及熔解曲線確認(rèn)了基因整合與持續(xù)表達(dá)。A375M荷瘤裸鼠按圖2G方案給藥后，圖2H~I顯示DR5-scFv組腫瘤重量顯著降低，腫瘤體積曲線下降（圖2J）；圖2K~L的H&E染色及TUNEL結(jié)果表明腫瘤組織壞死及凋亡增加。

圖1 DR5-scFv的構(gòu)建與抗腫瘤效應(yīng)表征。A）DR5-scFv與DR5蛋白的分子對(duì)接分析；B~C）CBB染色和DR5-scFv的WB分析；D）DR5-scFv和DR5蛋白之間的親和信號(hào)；E）5T-DR293-scFv細(xì)胞中DR5-scFv基因表達(dá)水平；F）CBB染色分析DR5-scFv；G）治療過(guò)程的示意圖；H）治療后實(shí)體瘤的代表性圖像；I）腫瘤重量；J）實(shí)驗(yàn)期間小鼠的腫瘤體積生長(zhǎng)曲線；K）不同組別腫瘤組織的H&E圖像；L）不同組腫瘤組織的TUNEL染色

（2）TP-siRC@tHyNPs的制備和表征

圖2A TEM結(jié)果顯示DR5-Exo呈囊泡狀，圖2B免疫電鏡顯示其膜表面高表達(dá)DR5-scFv；圖2C表明其含有CD9/CD63/TSG101；圖2D~F及圖2J顯示TP-siRC@Lip以DOPE為輔助脂質(zhì)，呈球形，EE=86.17±5.36%，DL=9.25±0.59%，粒徑135.77±2.95 nm、ζ電位近中性；圖2G~H 表明CYP3A4-siRNA對(duì)A375M細(xì)胞的抑制率為51.84±6.55%，傳代后表達(dá)回升；圖2I顯示了TP-siRC@Lip是由CYP3A4-siRNA與已包封TP的陽(yáng)離子脂質(zhì)體以 N/P=3:1 共孵育并通過(guò)靜電復(fù)合形成siRNA 脂質(zhì)復(fù)合物。2K~M顯示TP-siRC@tHyNPs由DR5-Exo:TP-siRC@Lip=2:1（w/w）經(jīng)凍融融合制得，F(xiàn)RET結(jié)果證實(shí)了其膜的成功融合；圖2N~P的免疫電鏡與WB結(jié)果表明其保留外泌體標(biāo)志物及DR5-scFv。圖2Q~R表明在pH 5.5時(shí)，其4 h累積釋放率為79.46±4.14%，血漿、儲(chǔ)存及稀釋穩(wěn)定性良好。

圖2 TP-siRC@tHyNPs的制備和表征。A~B）DR5-Exo的TEM圖和免疫電子顯微鏡圖像；C）DR5-Exo和Exo的WB分析；D）Lip的透射電鏡；E）TP@Lip的透射電鏡；F）藥物血脂比對(duì)TP@Lip EE%和DL%的影響；G）用靶向CYP3A4的不同siRNA序列處理的細(xì)胞中CYP3A4蛋白表達(dá)的WB分析；H）正常A3M細(xì)胞、siRNA-CYP4A375處理細(xì)胞和siRNA-CYP3A4處理后傳代細(xì)胞中CYP3A4蛋白表達(dá)的WB分析；I）不同N/P比制備的TP-siRC@Lip的AGE結(jié)果；J）TP-siRC@Lip的透射電鏡；K）TP-siRC@tHyNPs制備示意圖；L）以不同DR5-Exo與TP-siRC@Lip比制備的TP-siRC@tHyNPs的Zeta電位；M）FRET確認(rèn)TP-siRC@Lip和DR5-Exo之間的融合；P）TP-siRC@tHyNPs和TP-siRC@HyNPs中特征蛋白的WB分析；Q）TP-siRC@tHyNPs在pH 5.5和pH 7.4下的藥物釋放曲線；R）TP-siRC@tHyNPs的血漿穩(wěn)定性分析（24 h）

（3）細(xì)胞內(nèi)攝取、分布和代謝分析

圖3A的結(jié)果表明TP-siRC@Lip主要定位于核周（紅色）；圖3B顯示DR5-Exo與 Exo呈綠色核周分布且DR5-Exo熒光強(qiáng)度更高，而PKH67-DiD共定位黃色證實(shí)膜的成功融合，DAPI疊加后TP-siRC@tHyNPs的DiD信號(hào)顯著高于TP-siRC@HyNPs，證實(shí)了DR5功能化可提升遞送效率；圖3C線粒體共定位分析表明TP-siRC@tHyNPs與線粒體高度重疊；圖3D的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞4 h攝取達(dá)峰并于 6 h 下降；此外，圖3E細(xì)胞藥物濃度-時(shí)間曲線和相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表明，游離藥物組的TP在細(xì)胞內(nèi)快速代謝，半衰期為1.71±0.45小時(shí)。與CYP3A4-siRNA（TP&siRC@HyNPs，用Exo和siRC@Lip制備的TP和siRC@HyNPs的混合物）共同給藥，TP半衰期顯著延長(zhǎng)，達(dá)到5.08±0.51小時(shí)，增加了2.97倍。

圖3 細(xì)胞內(nèi)攝取、分布和代謝分析。A）熒光標(biāo)記的TP-siRC@Lip，Exo和DR5-Exo在A375M細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)分；B）TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs在A375M細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)分布；C）不同處理組脂質(zhì)體（紅色）和Exo（綠色）的定量熒光強(qiáng)度分析；D）流式細(xì)胞術(shù)分析用TP-siRC@tHyNPs處理的A375M細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度；E）不同處理組TP在A375M細(xì)胞中的藥物濃度-時(shí)間曲線

（4）體外抗腫瘤活性評(píng)估

圖4A~B結(jié)果表明，TP-siRC@tHyNPs使A375M細(xì)胞存活率降至最低，抑制率呈濃度依賴，顯著優(yōu)于TP、TP&siRC@HyNPs及TP-siRC@HyNPs；圖4C~G顯示3 TP-siRC@tHyNPs在3D球體模型中誘導(dǎo)的凋亡熒光最強(qiáng)；圖4D~H流式檢測(cè)結(jié)果顯示TP-siRC@tHyNPs組凋亡率為82.69 ± 2.48 %，顯著高于TP-siRC@HyNPs（58.31±4.02 %）和TP-siRC@Lip（44.57±3.55 %）；圖4E~I的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在24 h后，TP-siRC@tHyNPs組穿膜細(xì)胞數(shù)減少，侵襲抑制率21.78±3.16 %，優(yōu)于TP-siRC@HyNPs（13.44±2.31 %）。顯示其侵襲抑制率為21.78 ± 3.16 %；圖4F~J的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TP-siRC@tHyNPs組在12 h遷移距離縮短，遷移抑制率13.83±5.41 %，較TP-siRC@HyNPs（7.92±2.11 %）和TP-siRC@Lip（5.36±1.88 %）顯著增強(qiáng)。綜合表明TP-siRC@tHyNPs通過(guò)DR5靶向、CYP3A4沉默與TP協(xié)同，顯著抑制PMM細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡并阻斷侵襲遷移。

圖4 體外抗腫瘤活性評(píng)估。A) A375M細(xì)胞暴露于不同治療組24 h后的活力；B）用TP，TP&siRC@HyNPs，TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs處理的A375M細(xì)胞的細(xì)胞活力，TP濃度為50ng / ml；C）經(jīng)過(guò)不同處理的3D腫瘤球體模型中的細(xì)胞凋亡測(cè)定；D）流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理后A375M細(xì)胞凋亡；E）Transwell測(cè)定法對(duì)不同組別A375M細(xì)胞的抗侵襲作用；F）不同處理的A375M細(xì)胞的細(xì)胞遷移測(cè)定；G）3D腫瘤球體的定量熒光強(qiáng)度分析；H~J）定量分析不同治療組中A375M細(xì)胞的細(xì)胞凋亡百分比、侵襲率和遷移率

（5）體外潛在抗腫瘤機(jī)制的研究

TP-siRC@tHyNPs表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。圖5A~B中HMGB1、CRT的暴露及ATP釋放的增加，提示誘導(dǎo) ICD；圖5C~D中CD86熒光強(qiáng)度的升高，及CD206降低，表明巨噬細(xì)胞由M2向M1極化；圖5E流式細(xì)胞周期分析表明S期細(xì)胞比例由21 %增至53 %，G2/M 期由18 %降至9 %，呈現(xiàn)典型 S 期阻滯；；圖5F Western blot結(jié)果顯示，TP-siRC@tHyNPs處理后M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志p-STAT1、CD86、TNF-α和IL-6表達(dá)上調(diào)，M2型標(biāo)志CD206和Arg-1表達(dá)下調(diào)；凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、-8、-9、Bid、Bax及胞質(zhì)Cyto-c顯著升高，Bcl-2與NF-κB明顯降低；survivin和VEGF水平分別下降60%與64%，p-JAK2和p-STAT3磷酸化水平下降58%與62%。綜上表明TP-siRC@tHyNPs可通過(guò)同時(shí)激活外源-線粒體雙途徑凋亡、阻斷JAK2/STAT3通路并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化，協(xié)同抑制黑色素瘤細(xì)胞存活與血管生成。

圖5 體外潛在抗腫瘤機(jī)制的研究。A）CLSM圖像顯示不同處理的A375M細(xì)胞中的CRT暴露；B）A375M細(xì)胞中HMGB375的CLSM圖像；C）不同處理BMDCs中CD80+和CD86+細(xì)胞的FCM分析；D）不同處理的M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206+F4/80+表達(dá)的FCM分析；E）不同組的細(xì)胞周期分布；F）A375M細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的WB分析

（6）TP-siRC@tHyNPs的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布

使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)在體內(nèi)監(jiān)測(cè)TP-siRC@Lip，TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs的縱向動(dòng)態(tài)分布。圖6A顯示了熒光信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況。TP-siRC@Lip組注射后1 h肺部熒光幾乎檢測(cè)不到。相比之下，TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs在10分鐘時(shí)在腫瘤和腫瘤周圍區(qū)域都顯示出峰值熒光積累，且保留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12 h。值得注意的是，TP-siRC@tHyNPs組表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度，表明腫瘤選擇性增強(qiáng)并保留時(shí)間延長(zhǎng)。此外，圖6B-C器官的熒光成像結(jié)果表明注射后12 h，TP-siRC@tHyNPs組在肺部仍表現(xiàn)出最高的熒光積累；圖6D為游離TP、TP&siRC@HyNPs、TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs組的血漿濃度-時(shí)間曲線。經(jīng)分析可知，與游離TP相比，TP&siRC@HyNPs組TP的半衰期增加了1.2倍（t1/2= 0.16 ± 0.01 h），表明CYP3A4-siRNA能有效抑制TP代謝，顯著延長(zhǎng)其生物半衰期；圖7E提示TP-siRC@tHyNPs在肺（腫瘤）的TP濃度始終最高，10 min達(dá)峰后維持高濃度至12 h；非靶組織濃度最低，提示其具有選擇性靶向性及持續(xù)釋放能力。

圖6 TP-siRC@tHyNPs的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布。A）在特定時(shí)間間隔內(nèi)對(duì)接受TP-siRc@Lip、TP-siRC@HyNPs和TP- siRc@tHyNPs治療的患有肺轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的小鼠的熒光成像圖；B）給藥后12 h后分離組織的體外熒光圖像；C）組織中熒光強(qiáng)度的定量分析；D）TP、TP&siRC@HyNPs、TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs的血漿藥物濃度-時(shí)間曲線；E）在預(yù)定的給藥后時(shí)間點(diǎn)肺組織中的TP濃度

（7）TP-siRC@tHyNPs體內(nèi)抗PMM作用

接著，實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立兩種荷瘤小鼠模型研究了TP-siRC@tHyNPs對(duì)PMM的體內(nèi)療效。通過(guò)建立兩種荷瘤小鼠模型研究了 TP-siRC@tHyNPs 對(duì) PMM 的體內(nèi)療效。在最初的黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，圖7A為小鼠接受7劑治療，然后實(shí)施安樂(lè)死，并收集其肺進(jìn)行Bouin染色（圖7B）的示意圖；由圖7C~D H&E分析可知，對(duì)照組顯示廣泛的腫瘤結(jié)節(jié)，具有簇狀腫塊或索狀結(jié)構(gòu)（用箭頭表示），邊界明顯，細(xì)胞核擴(kuò)大和肺泡受壓。相比之下，TP-siRC@tHyNPs治療導(dǎo)致腫瘤結(jié)節(jié)面積大幅減少，肺泡結(jié)構(gòu)正常。肺組織的Ki67染色（圖7E）進(jìn)一步證明了TP和DR5-scFv的組合顯著抑制了腫瘤增殖。此外，圖7F的免疫組化（IHC）結(jié)果顯示TP組和TP&CYP3A4-siRNA組的裂解caspase 3表達(dá)增加，其中TP-siRC@tHyNPs組的信號(hào)最強(qiáng)；圖7G的TUNEL染色結(jié)果證實(shí)了這一趨勢(shì)，顯示TP-siRC@tHyNPs組的細(xì)胞凋亡率最高（80.34 ± 3.57%）。另外，CRT暴露分析進(jìn)一步表明，TP在體內(nèi)誘導(dǎo)ICD，并通過(guò)CYP3A4-siRNA共遞送和腫瘤靶向積累增強(qiáng)ICD（圖7H）；圖7I結(jié)果表明，其他組相比，TP-siRC@tHyNPs組的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)總數(shù)（TNMN）顯著減少圖7J的Kaplan-Meier生存曲線顯示TP-siRC@tHyNPs治療組具有顯著的生存優(yōu)勢(shì)。這些發(fā)現(xiàn)表明，CYP3A4-siRNA增強(qiáng)了TP的抗PMM作用，并且TP和DR5-scFv發(fā)揮了協(xié)同的腫瘤抑制作用。

圖7 TP-siRC@tHyNPs體內(nèi)抗PMM作用。A）給藥時(shí)間表的示意圖；B）不同處理后的肺組織的代表性圖像；C）肺切片的H&E染色；D）在高放大倍率下局部肺切片的放大視圖；E）肺組織切片的Ki67染色；F）不同組中裂解的caspase 3表達(dá)；G）不同治療組的肺組織中的凋亡細(xì)胞的TUNEL測(cè)定；H）不同組肺切片的CRT免疫染色I(xiàn)）不同治療組肺部TNMN的定量；J）荷瘤小鼠的生存曲線

（8）TP-siRC@tHyNPs的體內(nèi)抗PDX功效

此外，實(shí)驗(yàn)使用患者來(lái)源的異種移植（PDX）模型來(lái)評(píng)估TP-siRC@tHyNPs對(duì)肺轉(zhuǎn)移性腫瘤的抑制作用（圖8A）。圖8B~E為治療后收集的腫瘤體積、重量和抑制率數(shù)據(jù)，結(jié)果表明游離TP和DR5-scFv均能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。另外值得注意的是，該研究通過(guò)仿生系統(tǒng)的共同遞送進(jìn)一步增強(qiáng)了這種效果，其中TP-siRC@tHyNPs表現(xiàn)出最顯著的抑制作用。此外，圖8F結(jié)果表明，相比于其他組，TP-siRC@tHyNPs組的PDX小鼠的生存期顯著延長(zhǎng)；圖8G~H的腫瘤組織的H&E和TUNEL染色結(jié)果顯示治療組存在廣泛的壞死和廣泛的細(xì)胞凋亡。圖8I為裂解的caspase 3的IHC染色結(jié)果，分析表明，與對(duì)照組相比，TP和DR5-scFv修飾的細(xì)胞凋亡信號(hào)siRC@tHyNPs升高，其中TP-siRC@tHyNPs組顯示出最高比例的裂解caspase 3陽(yáng)性細(xì)胞，同時(shí)Ki67表達(dá)的免疫熒光分析（圖8J）進(jìn)一步支持了這一趨勢(shì)。此外，圖8K的CRT染色結(jié)果顯示TP誘導(dǎo)了顯著的表面CRT暴露，表明其具有ICD誘導(dǎo)潛力，同時(shí)實(shí)驗(yàn)通過(guò)siRC@tHyNPs系統(tǒng)共同遞送進(jìn)一步增強(qiáng)了ICD誘導(dǎo)潛力。

圖8 TP-siRC@tHyNPs的體內(nèi)抗PDX功效。A）給藥時(shí)間表示意圖；B） PBS、siRC@tHyNPs、TP和TP-siRC@tHyNPs組的腫瘤的代表性圖像；C）實(shí)驗(yàn)期間的腫瘤體積生長(zhǎng)曲線；D）不同組切除腫瘤的重量；E）治療組腫瘤生長(zhǎng)抑制率；F）不同治療下攜帶PDX腫瘤的小鼠的生存曲線；G）不同組腫瘤切片的H&E測(cè)定圖像；H~I）不同組的 TUNEL染色和裂解的caspase 3表達(dá)；J）腫瘤組織切片的Ki67免疫標(biāo)記；K）不同組腫瘤切片的CRT免疫染色