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針對上述問題，華南理工大學生物醫(yī)學科學與工程學院王均、袁友永團隊開發(fā)了一種生物仿生混合PROTAC脂質體遞送系統(tǒng)（M@TP），該系統(tǒng)能夠穿透血腦屏障并特異性靶向GBM細胞。進入TMZ耐藥性GBM細胞后，M@TP釋放的PROTAC可特異性降解BRD4，抑制DNA修復通路，恢復對TMZ的敏感性。體內實驗表明，M@TP在抑制TMZ耐藥性和術后GBM腫瘤生長方面效果顯著，并延長了小鼠生存時間，為克服TMZ耐藥性提供了潛在策略。該文章于2025年5月9日以《Biomimetic Hybrid PROTAC Nanovesicles Block Multiple DNA Repair Pathways to Overcome Temozolomide Resistance Against Orthotopic Glioblastoma》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202504253）。

研究示意圖

（1）BRD4通過增強DNA修復促進替莫唑胺耐藥性

研究發(fā)現(xiàn)，膠質母細胞瘤（GBM）細胞中BRD4表達與替莫唑胺（TMZ）耐藥性密切相關。實驗顯示，經(jīng)TMZ處理的人U251MG和鼠GL261膠質母細胞瘤細胞中BRD4表達呈濃度依賴性增加（圖1a）。在U251MG和GL261膠質瘤原位模型中，TMZ處理后組織中BRD4水平顯著升高（圖1c、d）。此外，TMZ耐藥細胞系中BRD4水平高于敏感細胞系，且BRD4表達與TMZ的IC50值呈正相關（圖1e、f）。全基因組RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞系中DNA修復相關基因表達上調，GO富集分析顯示與DNA修復相關的分子功能顯著富集（圖1g、h、i），GSEA分析也證實了核酸酶活性調控通路的上調（圖1j），表明BRD4可能通過促進DNA修復通路的激活，導致GBM細胞對TMZ耐藥性的發(fā)展。

圖1 膠質母細胞瘤（GBM）細胞中BRD4表達水平與替莫唑胺耐藥性相關。（a）Western blot分析不同濃度替莫唑胺處理后GBM細胞中BRD4表達水平及熱圖分析；（b）U251MG和GL261原位膠質瘤小鼠接受口服替莫唑胺治療方案示意圖；（c）和（d）有無替莫唑胺處理的GBM組織BRD4表達的免疫熒光圖像（標尺：100μm）和Western blot分析；（e）替莫唑胺敏感和耐藥細胞中BRD4表達的共聚焦熒光圖像（標尺：20μm）；（f）替莫唑胺敏感和耐藥細胞的IC50值及BRD4熒光強度比較；（g）轉錄改變的熱圖；（h）U251MG與U251MG-R細胞中差異表達基因的火山圖；（i）與DNA修復機制相關的差異表達基因的GO富集分析；（j）U251MG與U251MG-R細胞的GSEA分析

（2）通過下調GBM細胞中的BRD4表達來逆轉TMZ耐藥性

研究開發(fā)了一種靶向BRD4的PROTAC分子“Pro”，通過柔性連接臂將BRD4抑制劑JQ1與VHL E3連接酶配體連接。分子動力學模擬顯示Pro可與BRD4和VHL形成穩(wěn)定的三元復合物，關鍵殘基通過氫鍵和疏水作用相互連接，且模擬中BRD4和VHL的RMSD在20納秒后穩(wěn)定（圖2a、b）。蛋白質印跡法表明Pro以劑量依賴性方式降解TMZ敏感和耐藥GBM細胞中的BRD4，低至50 nM的濃度即可有效降解BRD4，且降解依賴于JQ1和VHL配體的結合（圖2c、d）。實驗還發(fā)現(xiàn)，Pro可顯著增強TMZ對耐藥GBM細胞的細胞毒性，即使在100:1的低比例下，也能將TMZ的IC50值從1277 μM降低至725.8 μM，并抑制TMZ誘導的BRD4上調，與TMZ表現(xiàn)出協(xié)同作用（圖2e、f）。這些結果表明Pro可有效克服TMZ耐藥性，增強其對耐藥GBM細胞的療效。

圖2 Pro通過下調GBM細胞中的BRD4表達逆轉TMZ耐藥性。（a）Pro、BRD4和VHL E3連接酶三元復合物的分子動力學模擬，綠色為VHL E3連接酶，紅色為BRD4蛋白；（b）三元復合物中蛋白質RMSD統(tǒng)計值，突顯最后100 ns的結構穩(wěn)定性；（c）Western blot分析不同濃度Pro處理的GBM細胞（U251MG、U251MG-R、GL261、GL261-R）中BRD4蛋白表達水平；（d）基于半定量分析的熱圖（n=3），顯示TMZ敏感和耐藥細胞在不同Pro濃度下的BRD4表達情況；（e）U251MG-R細胞經(jīng)TMZ和Pro不同比例處理48小時后的細胞毒性；（f）TMZ和Pro不同比例對U251MG-R細胞的IC50值和組合指數(shù)（CI）值

（3）M@TP的制備與表征

為解決PROTAC在膠質瘤治療中因藥代動力學欠佳和血腦通透性有限的問題，Pro通過二硫鍵與PC偶聯(lián)得到前藥PC-ss-Pro，其在高GSH水平的腫瘤環(huán)境中可特異性恢復蛋白降解活性。隨后，將TMZ和PC-ss-Pro以50:1比例與脂質材料結合制備成脂質體（TP），并進一步與U251MG-R細胞膜共擠壓，制備出具有穿血腦屏障和靶向GBM能力的仿生混合囊泡（M@TP）（圖3a）。高效液相色譜分析顯示，在10 mM GSH中，PC-ss-Pro可有效釋放活性藥物Pro（圖3b）。動態(tài)光散射分析表明，細胞膜摻雜后TP粒徑從160.8 nm增加到173.2 nm（圖3c），表面電荷從?43.6±1.4 mV降低到?40.6±1.1 mV（圖3d）。透射電子顯微鏡圖像顯示M@TP具有典型脂質體特征和球形囊泡形態(tài)（圖3e），且在生物相關溶液中粒徑一周內無明顯變化，表現(xiàn)出優(yōu)異穩(wěn)定性（圖S10）。熒光染料標記和熒光共振能量轉移實驗表明細胞膜與TP成功融合（圖3f、g、h），SDS-PAGE分析顯示M@TP與U251MG-R細胞膜具有相同蛋白質組成（圖3i）。在模擬生理和腫瘤微環(huán)境中，M@TP表現(xiàn)出藥物釋放動力學的pH和氧化還原響應性，72小時后TMZ和Pro的累積釋放率分別為73.3%和78.8%（圖3j、k）。這些結果證實了腫瘤微環(huán)境響應性仿生混合PROTAC納米囊泡的成功制備。

圖3 M@TP的制備與表征。（a）M@TP制備的示意圖；（b）Pro、PC和Pro-ss-PC在有無10 mM GSH處理下的HPLC譜圖；（c）TP、U251MG-R細胞膜（M）和M@TP的平均直徑；（d）TP、U251MG-R細胞膜（M）和M@TP的zeta電位；（e）M@TP的TEM圖像（標尺：200 nm）；（f）通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）獲得的DiD標記的TP（DiD-TP）和DiO標記的U251MG-R細胞膜（DiO-M）的共定位圖像（標尺：500 nm）；（g）FRET示意圖；（h）用FRET對偶染料（DiO和DiD）標記的脂質體與不同量的U251MG-R細胞膜融合以評估融合情況；（i）通過SDS-PAGE電泳確定的U251MG-R細胞、M、M@TP和TP的蛋白質組成；（j）和（k）M@TP在不同pH值（7.4或5.0）下與或無10 mM GSH孵育時釋放的TMZ和Pro的累積釋放

（4）體外抗腫瘤作用

研究發(fā)現(xiàn)，TMZ通過DNA甲基化造成DNA雙鏈斷裂發(fā)揮抗腫瘤作用，但其效果受多種DNA修復機制（如MGMT、Ku80和RAD51）的影響。實驗通過MTT試驗評估了M@TP在U251MG-R細胞中的毒性（圖4a），結果顯示M@T和M@P對細胞活力抑制較弱，而TP因BRD4耗竭增強TMZ敏感性，表現(xiàn)出更強細胞毒性；M@TP則顯示出最強的抗腫瘤活性，歸因于細胞膜修飾增加細胞攝取。流式細胞術檢測到TP處理組U251MG-R細胞凋亡率為21.1%，M@TP處理組凋亡率最高，達33.2%（圖4b）。γH2A.X作為TMZ誘導DNA損傷的標志物，其水平在TP處理組高于M@T和M@P處理組，而M@TP處理組γH2A.X水平最高，且DNA片段化最明顯（圖4c、d）。免疫熒光和蛋白質印跡分析顯示，含PC-ss-Pro的納米顆粒（M@P、TP和M@TP）顯著降低了U251MG-R細胞中BRD4蛋白水平（圖4e），并降低了TMZ耐藥相關蛋白（MGMT、Ku80和RAD51）的表達（圖4f、g），同時M@TP誘導了最高的γH2A.X水平（圖4g）。這些結果表明，M@TP通過降解BRD4，抑制DNA修復蛋白表達，增強DNA損傷，重塑U251MG-R細胞對TMZ的敏感性。

圖4 M@TP的細胞毒性及克服TMZ耐藥性的作用機制。（a）不同配方處理U251MG-R細胞48小時后的細胞毒性；（b）流式細胞術檢測不同配方處理U251MG-R細胞24小時后的凋亡分析結果餅圖；（c）不同配方處理U251MG-R細胞48小時后的彗星試驗代表性熒光圖像（標尺：100 μm）；（d）彗星試驗軟件項目（CASP）對（c）中DNA尾部長度的定量；（e）不同處理后U251MG-R細胞內BRD4水平的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像（標尺：10 μm）；（f）不同處理后U251MG-R細胞內MGMT、Ku80和RAD51水平的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像（標尺：5 μm）；（g）不同配方處理U251MG-R細胞后BRD4、MGMT、Ku80、RAD51、γH2A.X和β-actin蛋白水平的Western blot分析，統(tǒng)計學顯著性通過單因素方差分析（ANOVA）計算

（5）M@TP同源靶向特性的體外和體內評價

研究制備了帶有或不帶有膜修飾的Cy5標記脂質納米顆粒（M@Cy5 LNP和Cy5 LNP），并評估了它們在U251MG-R細胞中的攝取行為。結果顯示，M@Cy5 LNP在細胞質中的Cy5強度比Cy5 LNP高2.3倍（圖5a、b）。在不同細胞類型中，M@Cy5 LNP表現(xiàn)出特異性攝取能力。在3D多細胞腫瘤球體中，M@Cy5 LNP的熒光均勻分布于整個腫瘤球體，而Cy5 LNP僅限于外圍，表明M@Cy5 LNP具有更強的腫瘤穿透能力（圖5c）。在Transwell實驗中，M@Cy5 LNP在體外穿過血腦屏障的能力顯著優(yōu)于Cy5 LNP（圖5d）。此外，M@Cy5 LNP處理后，腦內皮細胞（bEnd.3）中關鍵緊密連接蛋白的表達水平發(fā)生變化，表明其可能通過調節(jié)緊密連接增強BBB穿透能力。

在體內實驗中，M@Cy5 LNP在原位膠質母細胞瘤小鼠腦腫瘤部位的熒光信號強烈，4小時達到峰值并持續(xù)至48小時，而Cy5 LNP和游離Cy5的熒光較弱（圖5e）。體外成像顯示，M@Cy5 LNP治療組的腦部熒光強度顯著高于其他組（圖5f、g）。藥代動力學分析表明，M@TP的全身循環(huán)時間顯著延長，其t1/2為9.61小時，比游離Pro（1.48小時）長六倍多，比TP（4.08小時）長兩倍多。M@TP的AUC值也顯著高于游離藥物和TP，表明其顯著增強了TMZ和Pro在血液中的滯留時間。這些結果表明，腫瘤細胞膜包覆的M@TP具有優(yōu)越的血腦屏障穿透能力和同型腫瘤靶向能力，為膠質母細胞瘤治療提供了有力支持。

圖5 體外和體內評估M@TP的同源靶向特性。（a）通過CLSM觀察Cy5 LNP和M@Cy5 LNP處理U251MG-R細胞2小時后的細胞攝取情況（標尺：20 μm）；（b）流式細胞術觀察Cy5 LNP和M@Cy5 LNP處理U251MG-R細胞2小時后的細胞攝取情況；（c）Cy5 LNP和M@Cy5 LNP在U251MG-R多細胞球體中的穿透能力（標尺：100 μm）；（d）使用Transwell實驗評估Cy5 LNP和M@Cy5 LNP穿過血腦屏障的能力，紅色為NPs（Cy5信號），藍色為Hoechst 33342標記的細胞核，綠色為Alexa Fluor 488鬼筆石堿標記的bEnd.3細胞骨架F-actin，bEnd.3和U251MG-R圖像的標尺為10 μm，血腦屏障層的標尺為5 μm；（e）體內注射后不同時間點，U251MG-R原位膠質母細胞瘤小鼠體內自由Cy5、Cy5 LNP或M@Cy5 LNP的分布情況；（f）體外熒光圖像，展示注射自由Cy5、Cy5 LNP或M@Cy5 LNP 24小時后U251MG-R原位膠質母細胞瘤小鼠主要器官和膠質瘤腫瘤的熒光圖像；（g）腦腫瘤切片的代表性熒光圖像，N為正常腦組織，T為腫瘤（標尺：100 μm）。統(tǒng)計顯著性通過Student's t-test計算

（6）在U251MG-R原位膠質母細胞瘤模型中克服替莫唑胺耐藥性

研究在攜帶替莫唑胺耐藥性U251MG-R-luc膠質母細胞瘤的小鼠體內評估了M@TP的抗腫瘤效果。小鼠在腫瘤細胞注射后第10天被隨機分為四組，分別靜脈注射PBS、M@T、M@P和M@TP，共五次（每三天一次）（圖6a）。結果顯示，M@TP治療組顯示出最強的抗腫瘤反應（圖6b、c），而M@T和M@P治療效果有限。接受M@T和M@TP治療的小鼠體重變化不明顯，而PBS組和M@P組體重顯著下降（圖6d）。生存曲線分析表明，M@TP治療組小鼠的中位生存期為59天，顯著長于其他組（圖6e）。H&E染色結果顯示M@TP組腫瘤病灶最?。▓D6f）。免疫熒光染色分析表明，M@TP誘導了Tunel陽性凋亡細胞和γH2A.X陽性核損傷，并顯著降低了DNA修復標志物（BRD4、MGMT、Ku80和RAD51）的表達（圖6g）。重要器官的H&E染色和血液生化檢測未發(fā)現(xiàn)明顯病變或異常（圖S20、S21）。這些結果表明，仿生混合PROTAC納米囊泡M@TP通過阻斷多種DNA修復途徑，在耐藥性膠質母細胞瘤治療中表現(xiàn)出優(yōu)異療效。

圖6 在U251MG-R原位膠質母細胞瘤模型中體內克服TMZ耐藥性。（a）U251MG-R-luc腫瘤小鼠抗腫瘤治療的示意圖；（b）U251MG-R-luc腫瘤小鼠在不同時間的體內成像；（c）不同治療后小鼠腫瘤生物發(fā)光強度的定量分析；（d）接受不同治療U251MG-R-luc腫瘤小鼠的體重變化；（e）不同治療后小鼠的Kaplan-Meier生存分析；（f）從每個組中切取的全腦進行H&E染色圖像（標尺：1 mm）；（g）每組原位腦腫瘤小鼠模型的Tunel、γH2A.X、BRD4、MGMT、Ku80和RAD51染色圖像（標尺：50 μm）。統(tǒng)計學顯著性通過單因素方差分析（ANOVA）計算

（7）TMZ與M@P在術后惡性膠質母細胞瘤模型中的聯(lián)合治療

為研究BRD4降解劑Pro抑制膠質母細胞瘤復發(fā)的潛力，GL261-luc膠質母細胞瘤細胞被正位接種到C57小鼠體內。在腫瘤接種后第16天，通過手術顯微鏡切除原發(fā)腫瘤組織，建立術后膠質母細胞瘤模型（圖7a、b）。手術后，生物發(fā)光信號顯著降低（圖7d），但H&E染色顯示存在殘留腫瘤灶（圖7c）。隨后，小鼠被分為四組（PBS、游離替莫唑胺、M@P和替莫唑胺+M@P），以評估抑制復發(fā)的療效。結果顯示，與PBS組相比，F(xiàn)ree TMZ或M@P治療僅輕微減少腫瘤復發(fā)（圖7d、e），而TMZ和M@P的聯(lián)合治療對顱內殘留腫瘤再生長表現(xiàn)出最顯著的抑制作用（圖7d、e）。此外，接受PBS治療的小鼠出現(xiàn)輕微體重減輕，而其他組未見顯著體重波動（圖7f）。接受TMZ加M@P治療的小鼠表現(xiàn)出顯著延長的生存時間和更高的腫瘤細胞凋亡率（圖7g、h）。這些結果表明，TMZ和M@P的聯(lián)合治療為抑制腫瘤復發(fā)、提高生存率和改善術后膠質母細胞瘤治療效果提供了一種有前景的策略。

圖7 評估TMZ與M@P聯(lián)合治療對惡性膠質母細胞瘤復發(fā)的療效。（a）聯(lián)合治療的示意圖；（b）手術腫瘤切除過程；（c）術后腦組織的代表性H&E圖像（標尺：500 μm）；（d）小鼠手術切除后膠質母細胞瘤的體內成像；（e）不同治療后小鼠腫瘤生物發(fā)光強度的定量分析，灰色箭頭指示手術切除日期，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（SD）表示（n=3）；（f）接受不同治療的小鼠體重變化；（g）接受不同治療的小鼠Kaplan-Meier生存曲線；（h）各組正位腦腫瘤小鼠模型的Tunel染色圖像（標尺：50 μm）。統(tǒng)計學顯著性通過單因素方差分析（ANOVA）計算

（8）通過TMZ和M@P聯(lián)合治療在體內重編程腫瘤免疫微環(huán)境

研究進一步分析了TMZ聯(lián)合M@P治療過程中膠質母細胞瘤（GBM）微環(huán)境中免疫細胞的組成。結果顯示，TMZ+M@P組腫瘤組織中浸潤性CD8+ T細胞比例顯著增加至12.8%，遠高于其他組；CD4+ T細胞浸潤率也顯著提高至27.3%（圖8a、b）。在脾臟中，TMZ+M@P組CD8+ T細胞群體也顯著增加（圖8c）。此外，TMZ+M@P組小鼠淋巴結中成熟樹突狀細胞（DCs）比例顯著上升至27%，而PBS組僅為9.42%（圖8d）。TMZ+M@P組還顯著降低了M2樣巨噬細胞比例，同時促炎M1樣巨噬細胞比例增加（圖8e）。此外，TMZ+M@P組產(chǎn)生最高濃度的TNF-α、干擾素（IFN）-γ和IL-6，而IL-10水平降低（圖8f）。這些結果表明，TMZ聯(lián)合M@P治療通過調節(jié)免疫細胞組成和細胞因子水平，顯著增強了抗腫瘤免疫反應。

圖8 TMZ聯(lián)合M@P在體內介導的腫瘤免疫微環(huán)境重編程。（a）流式細胞術定量分析腫瘤組織中CD8? T細胞百分比（門控于CD3? T細胞）（n=3）；（b）流式細胞術定量分析腫瘤組織中CD4? T細胞百分比（門控于CD3? T細胞）（n=3）；（c）脾臟中CD8? 和CD4? T細胞百分比的代表性流式細胞術定量分析（門控于CD3? T細胞）（n=3）；（d）不同治療后淋巴結中DCs成熟度的代表性流式細胞術定量分析（門控于CD11b?CD80?CD86?）（n=3）；（e）腫瘤組織中M1樣表型和M2樣表型巨噬細胞百分比的代表性流式細胞術定量分析（門控于CD45?CD11b?F4/80?細胞）（n=3）；（f）不同治療后血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10的熱圖（n=3）。統(tǒng)計學顯著性通過單因素方差分析（ANOVA）計算