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針對上述問題，四川大學(xué)張凌、黃詩琪團(tuán)隊受嬰兒無瘢痕愈合特性和凝膠滲透色譜原理啟發(fā)，開發(fā)了一種具有時空程序化釋放能力的多功能水凝膠系統(tǒng)（MLVgel）。該水凝膠通過動態(tài)硼酸酯鍵整合沒食子酸修飾的殼聚糖寡糖和苯硼酸接枝抗菌肽，實現(xiàn)了炎癥期Meloxicam的快速釋放和增殖期YQT-12肽靶向VP脂質(zhì)體的緩釋遞送。其創(chuàng)新特性包括：利用pH/ROS響應(yīng)性快速釋放抗炎抗菌成分，抑制炎癥和感染；通過脂質(zhì)體封裝和homo-FRET效應(yīng)抑制VP光毒性并增強(qiáng)靶向性，持續(xù)抑制YAP-TEAD通路；以及通過脂質(zhì)體摻雜降低摩擦系數(shù)，防止傷口二次感染。在動物模型中，MLVgel顯著加速傷口愈合，降低瘢痕指數(shù)，并提高成熟瘢痕的再生效率。多組學(xué)分析進(jìn)一步揭示其通過抑制YAP信號和重塑ECM結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用，為瘢痕治療提供了新的策略。該文章于2025年5月23日以《Mechanoregulative hydrogel facilitates rapid scarless healing by self-adaptive control of wound niche at different stages》為題發(fā)表于《Science Advances》期刊（DOI: 10.1126/sciadv.adv9895）。

圖1 研究示意圖

（1）L-乙?；鵙P的制備及表征

圖2A通過Simple Western blot分析顯示，VP處理顯著降低了L929成纖維細(xì)胞中TAZ、YAP、α-SMA和SMAD2/3的蛋白水平，證實其對YAP/TAZ通路的抑制作用。圖2B的免疫熒光圖像顯示，VP處理24小時后，細(xì)胞內(nèi)YAP表達(dá)明顯減少（藍(lán)色：DAPI染色細(xì)胞核；綠色：YAP）。圖2C的透射電鏡圖像顯示L-VP呈球形，粒徑均勻（約125 nm）。圖2D的電子順磁共振分析表明，完整L-VP在660 nm激光照射下不產(chǎn)生自由基，而破壞后的L-VP出現(xiàn)明顯自由基信號，證實脂質(zhì)體封裝可關(guān)閉VP光毒性。圖2E-H的流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡分析顯示，L-VP在成纖維細(xì)胞（L929）中的攝取效率顯著高于游離VP（熒光強(qiáng)度提高3倍），而在巨噬細(xì)胞（RAW264.7）中攝取較低，表明其具有成纖維細(xì)胞靶向性。這些結(jié)果表明，L-VP保留了VP的YAP抑制功能，解決了光毒性問題，并增強(qiáng)了靶向遞送效率，為瘢痕治療應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

圖2 VP和脂質(zhì)體的表征。（a）不同濃度VP處理L929細(xì)胞后，通過Western blot測定TAZ、YAP、α-SMA和SMAD2/3蛋白水平；（b）VP處理24小時后L929成纖維細(xì)胞的免疫熒光圖像（YAP染色，比例尺5 μm）；（c）L-VP的TEM圖像（比例尺500 nm）；（d）完整和破壞的L-VP在660 nm激光照射下不同時間點(diǎn)的ESR吸收曲線；（e）L929成纖維細(xì)胞攝取VP、l-VP和L-VP的流式細(xì)胞術(shù)代表性結(jié)果及（f）統(tǒng)計分析（n=3）；（g）RAW264.7巨噬細(xì)胞攝取VP、l-VP和L-VP的流式細(xì)胞術(shù)代表性結(jié)果及（h）統(tǒng)計分析（n=3）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，統(tǒng)計學(xué)顯著性通過單因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比較檢驗分析。DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；F.I.：熒光強(qiáng)度；a.u.：任意單位；ns：無顯著性差異

（2）MLVGEL的合成和表征

圖3A的11B核磁共振（NMR）光譜確認(rèn)了PBA成功偶聯(lián)到AMPs上，顯示出PBA特有峰；圖3B的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）結(jié)果證明了GA成功嫁接到COS上，顯示出CO-NH結(jié)構(gòu)振動峰偏移和酯鍵形成。圖3C展示了水凝膠形成圖像，圖3D和3E驗證了MLVgel的可注射性和自修復(fù)能力。圖3F的循環(huán)應(yīng)變實驗表明MLVgel具有良好的彈性恢復(fù)能力，圖3G顯示其對生物組織有良好粘附性。圖3H的低溫掃描電子顯微鏡（cryo-SEM）圖像顯示MLVgel具有三維孔結(jié)構(gòu)，且liposomes均勻分散，圖3I的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像進(jìn)一步確認(rèn)了liposomes的均勻分散。圖3J的X射線光電子能譜（XPS）全譜揭示了MLVgel中元素的均勻分布。圖3K的摩擦實驗表明含liposomes的水凝膠具有較低摩擦系數(shù)，顯示出良好的水化潤滑效果。圖3L的腫脹行為研究顯示MLVgel在12小時后達(dá)到腫脹平衡，具有良好的水分保持能力。圖3M顯示MLVgel在不同pH值和H?O?濃度下具有響應(yīng)性，表明其在模擬炎癥微環(huán)境中可釋放治療劑。這些結(jié)果表明MLVgel具備良好的注射性、自修復(fù)能力、生物粘附性、水化潤滑效果及環(huán)境響應(yīng)性，是一種有前景的傷口治療材料。

圖3 水凝膠的表征。（a）AMP、PBA和PBA-AMPs的11B NMR光譜；（b）COS和GA-COS粉末的FTIR光譜；（c）水凝膠形成的代表性圖像；（d）水凝膠的可注射性；（e）水凝膠的自修復(fù)特性；（f）水凝膠的循環(huán)應(yīng)變實驗（1%和300%應(yīng)變）；（g）水凝膠對生物組織的粘附性；（h）水凝膠的冷凍-SEM圖像（紅色箭頭指示暴露的脂質(zhì)體，比例尺分別為50 μm、3 μm和200 nm）；（i）含標(biāo)記脂質(zhì)體的水凝膠的CLSM圖像（比例尺2 μm）；（j）水凝膠的XPS全譜；（k）不銹鋼球與含/不含脂質(zhì)體的水凝膠之間的摩擦系數(shù)（n=5，載荷0.1 N）；（l）水凝膠的腫脹比（n=3）；（m）水凝膠在不同H?O?濃度（0.1、0.3、0.5、0.7 mM）和不同pH值（7.4、6.5、6、5.5）下的響應(yīng)行為圖像。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，統(tǒng)計顯著性通過t檢驗分析

（3）MLVGEL的體外治療作用

圖4A的細(xì)胞毒性實驗顯示，L929成纖維細(xì)胞與不同水凝膠共孵育3天后，細(xì)胞活力無顯著變化，表明水凝膠具有良好的生物相容性。圖4B的溶血實驗進(jìn)一步證實水凝膠的生物相容性，所有水凝膠組的溶血率均低于5%，紅細(xì)胞形態(tài)正常。圖4C的DPPH自由基檢測表明所有水凝膠的自由基清除效率均超過65%，顯示出強(qiáng)大的抗氧化效果；圖4D的DCFH-DA熒光信號檢測顯示MLVgel處理組信號顯著降低，證實其能有效抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激。圖4E和4F的流式細(xì)胞術(shù)顯示MLVgel顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞向M1表型極化，M1表型比例從29.5%降至1.89%。圖4G至4J的ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，MLVgel能下調(diào)促炎因子TNF-α、MCP-1和IL-6的表達(dá)，同時上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)。圖4K至4M的抗菌實驗表明，水凝膠對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）均具有強(qiáng)大抗菌活性，且在抑制MRSA方面優(yōu)于甲氧西林，對大腸桿菌的抑制效果更穩(wěn)定。

圖4 水凝膠在體外的影響。（a）L929成纖維細(xì)胞上不同水凝膠的細(xì)胞毒性實驗（3天，n=4）；（b）溶血實驗圖像及統(tǒng)計分析（n=6）；（c）水凝膠的DPPH自由基清除能力（n=3）；（d）H?O?處理的L929細(xì)胞中DCFH-DA的熒光圖像（比例尺50 μm）；（e）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果及（f）不同水凝膠處理后RAW264.7巨噬細(xì)胞極化的統(tǒng)計分析（n=3）；（g-j）ELISA檢測的細(xì)胞因子相對定量分析（n=3）；（k-m）水凝膠對金黃色葡萄球菌（S. aureus）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和銅綠假單胞菌的抗菌比定量分析（n=3）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析及Tukey多重比較檢驗

（4）MLVGEL增強(qiáng)了大鼠細(xì)菌感染傷口和燒傷傷口模型中無疤的傷口愈合

圖5A和5B結(jié)果顯示，MLVgel和LVgel組的傷口愈合速度顯著加快，傷口閉合率提高。圖5C和5D的細(xì)菌菌落計數(shù)實驗顯示，MLVgel組的細(xì)菌活力百分比降至接近90%，表現(xiàn)出強(qiáng)效抗菌能力。圖5E至5H的ELISA檢測結(jié)果表明，MLVgel能降低促炎因子（如TNF-α、MCP-1和IL-6）的表達(dá)，同時增加抗炎因子（如IL-10）的表達(dá)，調(diào)節(jié)傷口微環(huán)境。圖5I至5K的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，MLVgel處理后，M1表型巨噬細(xì)胞水平降低，M2表型水平略有增加，促進(jìn)傷口愈合。組織學(xué)分析顯示，MLVgel處理組的免疫細(xì)胞浸潤程度降低，基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)在第7天部分重建，第14天實現(xiàn)無疤痕皮膚再生，膠原蛋白排列規(guī)則，毛囊功能恢復(fù)。燒傷模型中，MLVgel處理組傷口閉合加速，潰瘍抑制。血液生化分析和主要器官的H&E染色圖像顯示MLVgel具有良好的生物安全性，處理組大鼠器官形態(tài)和結(jié)構(gòu)無顯著變化。

圖5 全皮層感染大鼠模型中的體內(nèi)傷口愈合效應(yīng)。（a）不同治療組SD大鼠各時間點(diǎn)的傷口照片（比例尺3 mm）；（b）不同時間點(diǎn)的相對傷口愈合率定量分析（n=4）；（c）3天治療后LB瓊脂板上活菌落照片及（d）統(tǒng)計分析（n=3）；（e-h）ELISA檢測TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-10的濃度（n=3）；（i）不同處理后SD大鼠傷口巨噬細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果及（j、k）統(tǒng)計分析（n=3）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析及Tukey多重比較檢驗

（5）MLVGEL在兔耳中約束HS

圖6A顯示各處理組兔耳傷口不同時間點(diǎn)的照片，MLVgel組傷口愈合效果顯著優(yōu)于PBS組，后者第28天傷口紅色、突起、質(zhì)地堅硬且表面光滑，而MLVgel組瘢痕更平坦，顏色和質(zhì)地接近正常組織。圖6B和D的H&E及Masson三色染色圖像和疤痕增生指數(shù)（SEI）定量分析表明，MLVgel顯著改善瘢痕增生情況。圖6C、E和F的Sirius Red染色圖像及膠原蛋白百分比和COL-I/III比值定量分析顯示，MLVgel減少膠原蛋白沉積，使膠原蛋白排列更有序，COL-I/III比例更合理。圖7A和B的組織透明化技術(shù)和三維熒光染色圖像顯示，MLVgel處理后瘢痕組織中YAP蛋白表達(dá)降低。圖7C和D的熱圖分析揭示MLVgel處理組與PBS組間差異表達(dá)基因和蛋白情況，表明MLVgel通過調(diào)節(jié)與傷口修復(fù)、纖維化抑制相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)來抑制瘢痕形成。

圖6 水凝膠對兔耳瘢痕形成的抑制效果。（a）各治療組兔耳傷口在不同時間點(diǎn)的照片（比例尺2 mm）；（b）第28天傷口的H&E和Masson三色染色圖像（比例尺2 mm）；（c）第28天傷口的Sirius Red染色圖像（比例尺1 mm）；（d）疤痕增生指數(shù)（SEI）、（e）膠原蛋白百分比和（f）COL-I/III比值的定量分析（n=3）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析及Tukey多重比較檢驗

圖7 兔耳瘢痕組織中生物蛋白表達(dá)。（a）YAP標(biāo)記的瘢痕組織成像流程圖；（b）組織透明化后的組織厚度圖，藍(lán)移表示Z軸尺度增加；（c）DAPI和YAP在瘢痕組織中的共定位圖像；（d）瘢痕組織中YAP分布的放大圖像，（a）和（c）中藍(lán)色框表示放大范圍；（e）瘢痕組織中YAP分布的橫截面圖像，藍(lán)色箭頭標(biāo)記高YAP表達(dá)的囊泡結(jié)構(gòu)（比例尺1 mm）；（f）YAP的三維熒光染色圖像；（g）差異表達(dá)基因熱圖分析（n=3）；（h）差異表達(dá)蛋白熱圖分析（n=3）

（6）MLVGEL在巴馬微型豬中既定的疤痕的治療功效

圖8A和B結(jié)果顯示，與對照組相比，LVgel和MLVgel處理組的傷口閉合率顯著提高，表明MLVgel能顯著促進(jìn)傷口愈合。圖8C至F的基因表達(dá)分析顯示，MLVgel處理組的α-SMA、YAP和TGF-β1表達(dá)水平最低，而MMP-1表達(dá)水平最高，表明MLVgel通過調(diào)節(jié)這些基因表達(dá)抑制瘢痕形成。圖8G至K的免疫組化染色和Western blot分析證實，MLVgel處理組中α-SMA、TGF-β和DCN的表達(dá)水平顯著降低。圖8L和M的組織學(xué)分析顯示，MLVgel處理組的表皮-真皮厚度更均勻，膠原蛋白沉積減少，COL-I/III比例更低，表明MLVgel在治療成熟瘢痕方面具有顯著效果。

圖8 疤痕皮膚的水凝膠處理。（a）各治療組豬皮膚傷口在不同時間點(diǎn)的照片（比例尺1 cm）；（b）不同時間點(diǎn)的相對傷口愈合率定量分析（n=8）；（c）α-SMA、（d）YAP、（e）TGF-β1和（f）MMP-1的相對mRNA表達(dá)（n=5）；（g）第56天傷口的免疫組化染色圖像（比例尺100 μm）；（h）第56天α-SMA和DCN的Western blot分析；（j）α-SMA和（k）TGF-β1的積分光密度（IOD）分析（n=6）；（l）表皮-真皮厚度定量分析，（m）膠原蛋白百分比和（n）COL-I/III比值（n=6）。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析及Tukey多重比較檢驗