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針對(duì)上述問(wèn)題，蘇州大學(xué)殷黎晨教授團(tuán)隊(duì)針對(duì)cfDNA-ROS-細(xì)胞因子三者的正反饋網(wǎng)絡(luò)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種多功能納米平臺(tái)RAW264.7細(xì)胞膜包覆的CeO?納米粒（RM-CeO?）,能夠同時(shí)、高效、穩(wěn)定清除三類炎癥介質(zhì)。該平臺(tái)在體外/體內(nèi)模型中驗(yàn)證了其同步捕獲cfDNA、清除ROS并中和關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子的能力，顯著打破炎癥循環(huán)，緩解自身免疫病理?yè)p傷，且具備良好的生物相容性與長(zhǎng)效穩(wěn)定性，為AIDs的聯(lián)合靶向治療提供了新策略。該文章于2025年7月22日以《Biomimetic Immunoregulators for the Multi-Target Inflammation Interruption in Autoimmune Diseases》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI:10.1021/acsnano.5c04655）。

圖1 研究示意圖

（1）NPs的制備和表征和H?O?觸發(fā)膜脫落

CeO? 納米粒子（平均粒徑 42.6 nm，ζ 電位 +26.0 mV）表面 Ce3?/Ce?? 共存（50.7 % / 49.3 %），兼具捕獲并剪切 cfDNA 的雙重功能。采用超聲融合法將 RAW264.7 細(xì)胞膜（RM）均勻包覆于 CeO?，構(gòu)建核–殼結(jié)構(gòu) RM-CeO? NPs。當(dāng) RM 蛋白與 CeO? 質(zhì)量比為 1 : 4 時(shí)，粒徑最?。?5.3 nm），ζ 電位逆轉(zhuǎn)至 ?18.5 mV（圖 2a,b）。TEM 可見連續(xù)膜層（圖 2c），室溫靜置 1 個(gè)月仍無(wú)沉淀（圖 S3）。DiO-RM-Cy5-CeO? 離心后上清熒光殘留 <15 %，證實(shí)膜包覆完整。Western blot 顯示 LFA-1、TNF-αR、IL-6R、IL-1βR、IFN-γR 等關(guān)鍵受體均得以保留（圖 2d）。鹽溶液中，裸 CeO? 在 200 μg mL?1 即聚集，而 RM-CeO? 至 1 000 μg mL?1 仍澄清。10 % FBS 孵育 8 h 后，裸粒子粒徑顯著增大且 ζ 電位轉(zhuǎn)負(fù)，而 RM-CeO? 尺寸與電位均保持穩(wěn)定（圖 2e,f）。RAW264.7 攝取實(shí)驗(yàn)表明，膜包覆使攝取量下降 2.3 倍（圖 2g）。

與 5 mM H?O? 共孵 1 h，CeO? 與 RM-CeO? 均產(chǎn)生明顯氣泡（圖 2h），溶解氧檢測(cè)顯示二者產(chǎn)氧速率相近（圖 2i）。100 μM H?O? 處理 4 h 后，RM-CeO? 粒徑由 55.3 nm 增至 330.4 nm，ζ 電位由負(fù)轉(zhuǎn)正（圖 2j,k）；而在 8 μM H?O?（生理水平）作用 24 h 內(nèi)，粒徑與電位均無(wú)明顯變化。FRET 實(shí)驗(yàn)顯示，100 μM H?O? 處理 4 h 后，Cy3-RM-Cy5-CeO? 的 FRET 效率由 0.15 降至 0.08，伴隨 Cy5 熒光減弱及 Cy3 熒光恢復(fù)（圖 2l）。CLSM 進(jìn)一步證實(shí)，DiO-RM-FITC-CeO? 經(jīng) 100 μM H?O? 刺激 4 h 后，共定位信號(hào)分離，Pearson 系數(shù)由 0.89 降至 0.17（圖 2m,n）。

圖2 RM-CeO?納米粒的表征及H?O?觸發(fā)膜脫落行為。（a，b）RM囊泡、CeO?與RM-CeO?的粒徑及ζ電位（n=3）；（c）CeO?與RM-CeO?的TEM圖像；（d）RM囊泡與RM-CeO?的Western blot蛋白譜；（e，f）10%FBS-DMEM中孵育不同時(shí)間后CeO?與RM-CeO?的粒徑及ζ電位變化（n=3）；（g）RAW264.7細(xì)胞與Cy5CeO?或RM-Cy5CeO?共孵4 h后的流式直方圖及單細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度（n=3）；（h）5 mM H?O?處理1 h后CeO?與RM-CeO?分散狀態(tài)照片；（i）200 mM H?O?中不同時(shí)間產(chǎn)生的O?量（n=3）；（j，k）100 μM H?O?孵育不同時(shí)間后RM-CeO?的粒徑與ζ電位變化（n=3）；（l）100 μM H?O?處理4 h前后Cy3RM-Cy5CeO?的FRET光譜（括號(hào)內(nèi)為效率）；（m）100 μM H?O?處理4 h前后DiORM-FITCCeO?的CLSM圖像；（n）對(duì)應(yīng)（m）中FITCCeO?與DiORM的Pearson相關(guān)系數(shù)（n=3）

（2）RM-CeO?納米粒體外功能表征

BNPP 模型顯示，CeO? 對(duì) DNA 的水解常數(shù) Vmax = 4.70×10?? s?1，Km = 1.80 mM；細(xì)胞膜包覆后活性驟降，而 100 μM H?O? 預(yù)處理 4 h 可剝除膜層，使 RM-CeO? 的 Vmax（4.48×10?? s?1）與 Km（1.74 mM）幾乎完全復(fù)原（圖 3a,b）。FAM-BHQ-1 TaqMan 探針實(shí)驗(yàn)表明，RM-CeO? 單獨(dú)作用 9 h 熒光無(wú)升高，H?O? 預(yù)處理后熒光迅速回升，并能在連續(xù)四輪補(bǔ)充探針中保持切割效率；即使 CeO?/探針質(zhì)量比降至 2，仍可實(shí)現(xiàn)完全降解。瓊脂糖凝膠顯示，≥25:1 時(shí) CeO? 開始結(jié)合 pDNA，≥100:1 時(shí)完全結(jié)合；4 h 后 ≥25:1 條帶出現(xiàn)小片段，≥100:1 條帶消失（圖 3d）。RAW264.7 超聲裂解產(chǎn)生的 DAMPs 經(jīng) CeO? 或 H?O? 預(yù)處理 RM-CeO? 處理后均被高效剪切（圖 3e），并分別使 HEK-Blue mTLR9 細(xì)胞的 TLR9 激活降低 47% 與 50%（圖 3f）。與 PAMAM-G3 相比，H?O? 預(yù)處理的 RM-CeO? 在血清和肝素存在下仍能徹底清除 CpG，避免競(jìng)爭(zhēng)置換導(dǎo)致的 cfDNA 再暴露（圖 S10）。ROS 清除實(shí)驗(yàn)表明，CeO? 與 RM-CeO? 對(duì) H?O?、O??、·OH 均具同等高效清除能力（圖 3g）。細(xì)胞因子中和實(shí)驗(yàn)顯示，RM-CeO? 可濃度依賴地抑制 TNF-α、IL-6、IL-1β，IC?? 分別為 735、1634、1296 μg/mL，而紅細(xì)胞膜包覆的 EM-CeO? 幾乎無(wú)效。

圖3 RM-CeO?納米粒體外功能表征。（a）BNPP底物飽和度曲線（n=3）；（b）Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖（n=3）；（c）TaqMan探針熒光時(shí)間曲線，箭頭示0、2、4、6 h補(bǔ)加探針（n=3）；（d）遞增CeO?/pDNA質(zhì)量比下pDNA 4 h瓊脂糖凝膠圖；（e）超聲DAMPs經(jīng)PBS、CeO?、RM-CeO?或H?O?預(yù)處理RM-CeO?處理后的瓊脂糖凝膠圖；（f）DAMPs存在時(shí)HEK-Blue mTLR9細(xì)胞TLR9激活水平（n=3）；（g）CeO?與RM-CeO?對(duì)H?O?、O??、·OH的殘留量（n=3）；（h）RM-CeO?不同濃度下TNF-α、IL-6、IL-1β殘留濃度（n=3）

（3）體外抗炎和抗氧化RM-CeO2 NPs的效率

在RAW 264.7細(xì)胞模型中，經(jīng)CpG、LPS、IL-1β、超聲或阿霉素誘導(dǎo)的DAMPs刺激后，100 μM H?O?預(yù)處理4 h的RM-CeO?納米粒較裸CeO?及RM囊泡更顯著降低TNF-α與IL-6分泌（圖4a、b）；200 μg/mL CeO?條件下，RM-CeO?無(wú)論是否經(jīng)H?O?預(yù)處理均無(wú)明顯細(xì)胞毒性，且對(duì)未受刺激細(xì)胞的TNF-α/IL-6分泌影響極?。▓DS13）。LPS（10 ng/mL）刺激使RAW 264.7細(xì)胞ROS水平顯著升高并伴隨形態(tài)激活，CeO?與RM-CeO?處理將胞內(nèi)ROS降低約98%，細(xì)胞保持靜息形態(tài)，RM囊泡無(wú)此效應(yīng)（圖4c）。

圖4 RM-CeO?納米粒的體外抗炎與抗氧化效能。（a）RAW264.7細(xì)胞經(jīng)CpG、LPS、IL-1β、超聲DAMPs或Dox-DAMPs刺激后與不同納米粒共孵24 h的TNF-α分泌水平（n=3）；（b）對(duì)應(yīng)IL-6分泌水平（n=3）；（c）RAW264.7細(xì)胞與LPS及不同納米粒共孵24 h后經(jīng)DCFH-DA染色的CLSM圖像及每細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度（n=3）

（4）RM-CeO2 NPs與商業(yè)清除劑免疫調(diào)節(jié)效率的比較

在10 μg/mL PAMAM-G3、5 μg/mL CAT 和 1 μg/mL 抗TNF-α 分別與 50 μg CeO?/mL RM-CeO? 等效清除 CpG、H?O? 與 TNF-α的條件下，將 RAW264.7 細(xì)胞同時(shí)暴露于 CpG/H?O?/TNF-α 混合物后，RM-CeO? 較三種單靶點(diǎn)清除劑顯著降低 TNF-α 與 IL-6 分泌，并抑制胞內(nèi) H?O? 水平（圖 5a–c）。在 Transwell 共培養(yǎng)體系中，經(jīng) CpG/H?O?/TNF-α 刺激的 RAW264.7 細(xì)胞誘導(dǎo)新生 RAW264.7 向 M1 極化、DC2.4 成熟，并觸發(fā)中性粒細(xì)胞 NETs（dsDNA、MPO、MMP-9）生成；RM-CeO? 處理顯著抑制上述免疫激活，而單靶點(diǎn)清除劑作用有限（圖 5d–k）。

圖5 RM-CeO?納米粒與商品化清除劑的免疫調(diào)控效能比較。（a）RAW264.7細(xì)胞與CpG/H?O?/TNF-α混合物及PBS、RM-CeO?、PAMAM-G3、CAT或抗TNF-α共孵24 h后的TNF-α分泌水平（n=3）；（b）對(duì)應(yīng)IL-6分泌水平（n=3）；（c）胞內(nèi)H?O?水平（n=3）。（d）RAW264.7細(xì)胞流式直方圖；（e）由d計(jì)算所得M1型巨噬細(xì)胞（CD86?）比例（n=3）；（f）M2型巨噬細(xì)胞（CD206?）比例（n=3）。（g）DC2.4細(xì)胞流式直方圖；（h）由g計(jì)算所得成熟樹突狀細(xì)胞（CD40?CD80?）比例（n=3）。（i）中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清中dsDNA濃度（n=3）；（j）MPO濃度（n=3）；（k）MMP-9濃度（n=3）

（5）NPs的藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布和體內(nèi)氮?dú)忉尫?/span>

靜脈注射后，RM-^Cy5CeO?與EM-^Cy5CeO?的循環(huán)半衰期分別為^Cy5CeO?的5.0倍與4.6倍（圖6a）；CIA模型鼠踝關(guān)節(jié)熒光顯示RM-Cy5CeO?強(qiáng)度為^Cy5CeO?的3.2倍、EM-^Cy5CeO?的2.1倍（圖6b、c），且第4天關(guān)節(jié)信號(hào)降至峰值15%以下，肝臟累積低于^Cy5CeO?。ConA誘導(dǎo)AIH模型中，RM-^Cy5CeO?肝臟累積為^Cy5CeO?的3.5倍，健康與AIH肝臟細(xì)胞外比例均>80%，肝巨噬細(xì)胞攝取顯著低于裸CeO?。光聲成像示CIA踝關(guān)節(jié)在注射RM-CeO?后1 h O?信號(hào)顯著增強(qiáng)（圖6d）；FRET檢測(cè)表明血循環(huán)中Cy3RM-^Cy5CeO?的FRET效率24 h不變，而CIA關(guān)節(jié)24 h效率明顯降低（圖6e、f），健康關(guān)節(jié)內(nèi)FRET效率恒定。CIA小鼠中，RM-CeO?顯著降低滑膜液與血清cfDNA及dsDNA水平，CeO?因關(guān)節(jié)富集不足而滑膜清除效率低，血清清除與RM-CeO?相當(dāng)。

圖6 RM-CeO?納米粒的藥動(dòng)、分布及體內(nèi)膜脫落。（a）健康小鼠靜脈注射后血漿Cy5CeO?、EM-Cy5CeO?與RM-Cy5CeO?濃度曲線及括號(hào)內(nèi)半衰期（n=3）；（b）CIA小鼠靜脈注射Cy5CeO?制劑后不同時(shí)間熒光成像；（c）24 h離體踝關(guān)節(jié)熒光成像及定量強(qiáng)度（n=3）；（d）CIA及健康小鼠踝關(guān)節(jié)靜脈注射PBS或RM-CeO?后不同時(shí)間氧合血紅蛋白光聲成像；（e）靜脈注射Cy3RM-Cy5CeO?后4 h與24 h血液及滑膜FRET效率（n=3）；（f）靜脈注射Cy3RM-Cy5CeO?后4 h與24 h離體踝關(guān)節(jié)FRET信號(hào)熒光成像（λex=550 nm，λem=670 nm，n=3）

（6）RM-CeO?納米粒治療CIA小鼠的療效

CIA小鼠經(jīng)RM-CeO?干預(yù)后，關(guān)節(jié)腫脹與體重下降顯著緩解，臨床評(píng)分最低（圖7a,b）；血清及滑膜cfDNA、dsDNA及TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α水平均顯著低于CeO?組（圖7c、d），MMP-1、-2、-3、-9下調(diào)50–60%?；?O?與ROS恢復(fù)至正常水平（圖7e），MPO降低71%（圖7f）。與抗TNF-α相比，RM-CeO?在下調(diào)TNF-α外仍顯著降低其他炎癥介質(zhì)與dsDNA，關(guān)節(jié)消腫更優(yōu)。流式結(jié)果顯示，RM-CeO?使滑膜浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞（F4/80?CD11b^high）減少51%，M2型比例升高、M1型降低（圖7g–j），并抑制CD3?T細(xì)胞向Th1（IFN-γ?）和Th17（IL-17?）分化。

圖7 RM-CeO?納米粒治療CIA小鼠的療效。（a）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸；（b）實(shí)驗(yàn)全程后肢厚度變化（n=6）；（c）第57天血清cfDNA與dsDNA濃度（n=6）；（d）第57天滑膜促炎細(xì)胞因子水平（n=6）；（e）第57天滑膜H?O?含量（n=6）；（f）第57天滑膜MPO含量（n=6）；（g）第57天滑膜細(xì)胞流式直方圖；（h）由g計(jì)算的浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞（F4/80?CD11b^high）比例（n=6）；（i）M1型巨噬細(xì)胞（F4/80?CD11b?CD86?）比例（n=6）；（j）M2型巨噬細(xì)胞（F4/80?CD11b?CD206?）比例（n=6）

（7）RM-CeO?納米粒在CIA小鼠中的關(guān)節(jié)保護(hù)與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)

H&E染色顯示RM-CeO?使滑膜增厚及粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著受抑，組織學(xué)評(píng)分下降74%（圖8a、d）；番紅O與Masson染色示其軟骨退變及纖維化面積分別減少86%與65%，療效優(yōu)于CeO?（圖8b、c、e、f）。Micro-CT示關(guān)節(jié)表面骨侵蝕明顯減輕（圖8g），骨密度、骨表面積/體積、骨表面積密度及骨小梁厚度均恢復(fù)至健康鼠水平（圖8h–k）。RM-CeO?處理后CIA小鼠最大耐受轉(zhuǎn)速由17 rpm升至70 rpm，運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)（圖8l）。

圖8 RM-CeO?納米粒在CIA小鼠中的關(guān)節(jié)保護(hù)與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。（a–c）關(guān)節(jié)切片H&E、番紅O及Masson染色代表性顯微圖（標(biāo)尺100 μm）；（d）由a計(jì)算的組織學(xué)評(píng)分（n=6）；（e）由b計(jì)算的軟骨退變等級(jí)（n=6）；（f）由c計(jì)算的纖維化面積（n=6）；（g）右踝關(guān)節(jié)Micro-CT代表性圖像，紅色圓圈示骨破壞區(qū)域；（h–k）由g計(jì)算的骨密度、骨表面積/體積、骨表面積密度及骨小梁厚度（n=6）；（l）CIA小鼠最大耐受轉(zhuǎn)速（n=6）

（8）RM-CeO?納米粒治療AIH小鼠的療效

AIH小鼠經(jīng)RM-CeO?干預(yù)后，體重回升，肝脾指數(shù)恢復(fù)（圖9b、c）；血清cfDNA與dsDNA分別下降82%和79%（圖9d），肝臟TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α、IFN-γ、IL-17A降至正常，IL-4與IL-10分別升高1.3倍和2.4倍（圖9e）；ROS、MDA下降，GSH/GSSG升高，MPO降低71%（圖9f–i）。流式顯示肝F4/80?CD11b^high巨噬細(xì)胞減少66%，M1型下降、M2型上升，Th1與Th17分別減少68%和70%。H&E示肝壞死、浸潤(rùn)及脂肪變性改善，臨床評(píng)分降低64%，肝凋亡減少86%（圖9j–m）。健康小鼠靜脈注射10 mg/kg RM-CeO?后，主要器官無(wú)病理?yè)p傷，血常規(guī)與生化指標(biāo)基本正常。

圖9 RM-CeO?納米粒治療AIH小鼠的療效。（a）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸；（b）AIH小鼠肝指數(shù)（n=6）；（c）AIH小鼠脾指數(shù)（n=6）；（d）血清cfDNA及dsDNA濃度（n=6）；（e）肝臟細(xì)胞因子水平（n=6）；（f）肝臟ROS水平（n=6）；（g）肝臟MDA水平（n=6）；（h）肝臟GSH/GSSG比值（n=6）；（i）肝臟MPO水平（n=6）；（j）肝臟H&E染色代表性圖像（標(biāo)尺100 μm，黃、紅、綠箭頭分別示炎癥浸潤(rùn)、壞死及脂肪變性）；（k）由j計(jì)算的臨床評(píng)分（n=6）；（l）肝臟TUNEL染色代表性圖像（標(biāo)尺20 μm，DAPI染核）；（m）由l計(jì)算的凋亡指數(shù)（n=6）