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研究背景：

針對(duì)上述問(wèn)題，重慶醫(yī)科大學(xué)曹陽(yáng)教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種靶向血栓的多功能納米復(fù)合材料，結(jié)合光熱治療、藥物輸送和微環(huán)境調(diào)控，旨在實(shí)現(xiàn)協(xié)同溶栓。具體包括利用高生物相容性且具有吸附和導(dǎo)熱特性的多孔法明藍(lán)（MPB）納米顆粒負(fù)載血栓溶解藥物UK，并在其表面包覆血小板膜以實(shí)現(xiàn)靶向。該復(fù)合材料在808 nm激光照射下能促進(jìn)局部加熱、同時(shí)釋放UK和一氧化氮（NO），實(shí)現(xiàn)光熱-藥物聯(lián)合的高效溶栓，同時(shí)抑制ROS、補(bǔ)充NO，防止血栓復(fù)發(fā)，并具有良好的影像檢測(cè)能力，為血栓的精準(zhǔn)治療提供了新思路。該文章于2025年4月15日以《Mechanical Biomimetic Nanocomposites for Multidimensional Treatment of Arterial Thrombosis》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202501134）。

研究示意圖

（1）MPB-NO-UK@PM的表征

MPB-NO 由直徑約 150 nm 的均勻方形顆粒組成，其制備方法為將 SNP 嵌入 MPB 框架（圖 1A, B）。FTIR 光譜顯示 MPB-NO 存在 N=O 振動(dòng)峰，證明 SNP 已成功嵌入 MPB 框架（圖 1C）。元素映射證實(shí) MPB-NO 中氧元素分布均勻（圖 1D）。透射電子顯微鏡圖像顯示 MPB-NO-UK 具有核殼結(jié)構(gòu)，證明血小板膜成功包覆（圖 1E）。DLS 結(jié)果表明，血小板膜包覆后，MPB-NO-UK 的平均直徑從 182.2 ± 4.7 nm 增加到 202.6 ± 2.9 nm（圖 1F）。SDS-PAGE 結(jié)果顯示 MPB-NO-UK@PM 上的血小板膜與源血小板膜具有一致性，表明血小板膜包覆保持了其完整性（圖 1G）。zeta電位測(cè)量結(jié)果顯示，MPB-NO 和 UK 的電位相反，有利于提高 UK 的載藥效率（圖 1H）。MPB-NO-UK@PM 納米粒子的粒徑和分散性在一周的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)保持穩(wěn)定（圖1I）。

圖1 納米復(fù)合材料的表征。（A,B）MPB-NO的TEM和HRTEM圖像；（C）MPB-NO和MPB的FTIR光譜；（D）MPB-NO的元素分布圖；（E）MPB-NO-UK@PM的TEM圖像；（F）MPB-NO-UK和MPB-NO-UK@PM的粒徑分布；（G）PM和MPB-NO-UK@PM的SDS-PAGE分析，1表示PM，2表示MPB-NO-UK@PM；（H）MPB-NO、UK、PM和MPB-NO-UK@PM的電位；（I）MPB-NO-UK@PM在一周內(nèi)的粒徑分布和多分散指數(shù)（PDI）

（2）MPB-NO-UK@PM的體外性質(zhì)

808 nm 激光照射 10 min，MPB-NO 升溫 21.8 °C，PBS 無(wú)變化（圖 2A）；MPB-NO-UK@PM 的升溫幅度隨濃度和功率線性增加（圖 2B–D）。710 nm 激發(fā)下，其光聲信號(hào)強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系（圖 2D）。MPB-NO 僅在激光輻照時(shí)釋放 NO，SNP 及 MPB 無(wú)響應(yīng)（圖 2F）；NO 釋放量隨功率密度和照射時(shí)間遞增（圖 2G）。24 h 內(nèi)，808 nm 激光照射使 UK 釋放達(dá) 82.7%，無(wú)激光時(shí)僅 45%（圖 2H）。TMB 比色測(cè)定顯示 MPB-NO-UK@PM 具有 POD 活性且隨時(shí)間增強(qiáng)（圖 2I）。溶氧儀測(cè)得 H?O?+MPB-NO-UK@PM 體系 O? 顯著增加，提示 CAT 活性隨時(shí)間升高（圖 2J）。WST-8 結(jié)果顯示 SOD 活性隨 MPB-NO-UK@PM 濃度升高而增強(qiáng)（圖 2K）。

圖2 MPB-NO-UK@PM的體外特性。（A）MPB、MPB-NO和PBS的溫度變化曲線；（B）不同濃度下MPB-NO-UK@PM的溫度變化曲線；（C）不同激光功率下的溫度升高曲線；（D）不同濃度下MPB-NO-UK@PM的熱成像；（E）體外信號(hào)-濃度關(guān)系的定量分析及不同濃度下MPB-NO-UK@PM的PA圖像；（F）在1 W cm?2功率密度下，SNP、MPB和MPB-NO的NO釋放曲線；（G）在不同功率密度下MPB-NO-UK@PM的NO釋放曲線；（H）激光照射與否下MPB-NO-UK@PM的UK釋放；（I）添加TMB底物溶液后的650 nm吸光度；（J）溶解氧儀測(cè)得的O2濃度；（K）不同濃度下MPB-NO-UK@PM的SOD活性

（3）剪切力對(duì)Piezo1激活的影響

在正常層流剪切力下，Piezo1通道被激活，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2?增加，進(jìn)而激活eNOS，促進(jìn)NO產(chǎn)生（圖3A）。通過(guò)熒光顯微鏡觀察不同剪切力對(duì)HUVECs中Ca2?水平的影響，結(jié)果表明在15 dyn cm?2時(shí)熒光信號(hào)最強(qiáng)，而在30和45 dyn cm?2時(shí)內(nèi)源性Ca2?水平顯著下降（圖3B）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證，剪切力從3增加到15 dyn cm?2時(shí)內(nèi)源性Ca2?水平上升，但在30和45 dyn cm?2時(shí)下降（圖 3C,D）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，隨著剪切力從3增加到15 dyn cm?2，磷酸化eNOS（Ser1177）水平上升，但在更高剪切力下則下降（圖 3E,F）。

圖3 不同剪切力對(duì)Piezo1通道激活和Ca2?流入的影響。（A）剪切力、Piezo1通道激活、eNOS激活和NO產(chǎn)生之間的關(guān)系示意圖；（B）不同剪切力刺激下HUVECs內(nèi)源性Ca2?濃度的Fluo-4 AM熒光顯微鏡觀察；（C）不同剪切力刺激下HUVECs內(nèi)源性Ca2?濃度的流式細(xì)胞術(shù)分析；（D）流式細(xì)胞術(shù)熒光強(qiáng)度分析；（E）HUVECs中磷酸化eNOS（Ser1177）水平的共聚焦顯微鏡圖像；（F）對(duì)應(yīng)磷酸化eNOS（Ser1177）水平的平均熒光信號(hào)

（4）細(xì)胞內(nèi)攝取和粘附特性、抗血小板聚集能力和H2O2清除能力

巨噬細(xì)胞內(nèi) MPB-NO-UK@PM 熒光弱（圖 4A）。HUVECs 與活化血小板共定位：MPB-NO-UK@PM 信號(hào)重疊度高于 Dil-MPB-NO-UK（圖 4B）?；罨?HUVECs 對(duì) MPB-NO-UK@PM 的攝取量顯著高于未活化組（圖 4C）。濁度測(cè)定：?jiǎn)为?dú) MPB-NO-UK@PM 的聚集率 50.9%，與 PBS 無(wú)差異；+NIR 后降至 31.7%（圖 4D）。SEM 驗(yàn)證該結(jié)果（圖 4E）。H?O? 誘導(dǎo)的 HUVECs 內(nèi)，MPB-NO-UK@PM 顯著降低 ROS（圖 4F）。H?O? 組凋亡率升高，MPB-NO 和 MPB-NO-UK@PM 均使其回落（圖 4G）。

圖4  MPB-NO-UK@PM的細(xì)胞內(nèi)攝取、粘附特性、抗血小板聚集能力及H?O?清除能力。（A）MPB-NO-UK@PM在RAW 264.7細(xì)胞中的吞噬逃逸的共聚焦顯微鏡圖像；（B）MPB-NO-UK@PM靶向活化血小板的共聚焦顯微鏡圖像；（C）MPB-NO-UK@PM靶向活化HUVECs的共聚焦顯微鏡圖像；（D）NIR照射下NO生成的抗血小板聚集效果（n = 3）；（E）血小板聚集程度的透射電子顯微鏡圖像；（F）不同處理后HUVECs中的ROS清除情況；（G）對(duì)應(yīng)的ROS水平的平均熒光信號(hào)

（5）體外和體內(nèi)生物安全性

HUVECs和RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，MPB-NO-UK@PM的不同濃度未表現(xiàn)出顯著細(xì)胞毒性（圖5A）。采用活/死細(xì)胞雙染色法評(píng)估光熱治療對(duì)HUVECs的損傷，結(jié)果顯示未出現(xiàn)異常細(xì)胞狀態(tài)（圖5B）。與PBS處理的陰性對(duì)照相比，稀釋的紅細(xì)胞在與不同濃度的MPB-NO-UK@PM和MPB-NO共孵育后，離心后呈現(xiàn)清澈溶液（圖5C,D）。將MPB-NO-UK@PM注入斯普拉格-道利大鼠后，在第1、7和14天進(jìn)行評(píng)估，未觀察到血液學(xué)參數(shù)（圖5E）和主要臟器（心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）的組織切片（圖5F）顯著變化。

圖5 體內(nèi)外生物安全性評(píng)估。（A）RAW264.7細(xì)胞和HUVECs與MPB-NO-UK@PM共同培養(yǎng)后的相對(duì)細(xì)胞活力；（B）NIR照射后活/死HUVECs的共聚焦顯微鏡圖像；（C）與不同濃度MPB-NO-UK@PM共同培養(yǎng)后的紅細(xì)胞圖像；（D）與不同濃度MPB-NO-UK@PM和MPB-NO共同培養(yǎng)的血樣在540 nm處的吸光度，PBS和超純水作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；（E）SD大鼠的血常規(guī)；（F）SD大鼠主要臟器的H&E染色結(jié)果

（6）MPB-NO-UK@PM在血栓中的靶向能力及體內(nèi)分布

在體外血栓中，MPB-NO-UK@PM的熒光顯著高于MPB-NO-UK和對(duì)照組DiR，表明其具有更強(qiáng)的血栓靶向性（圖6A,B）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，MPB-NO-UK@PM對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血栓的靶向能力優(yōu)于MPB-NO-UK，表現(xiàn)為更強(qiáng)的血栓熒光信號(hào)（圖6C, D）。納米復(fù)合材料在體內(nèi)不會(huì)長(zhǎng)期滯留，能夠被有效清除。MPB-NO-UK@PM的血藥半衰期（5.886 h）顯著長(zhǎng)于MPB-NO-UK（3.907 h），表明血小板膜包覆增強(qiáng)了藥物的體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性（圖6E, F）。

圖6 MPB-NO-UK@PM在血栓中的靶向能力及體內(nèi)分布。（A）不同處理后富血小板血栓的熒光圖像及強(qiáng)度；（B）富血小板血栓熒光強(qiáng)度的定量分析；（C）不同時(shí)間點(diǎn)頸動(dòng)脈血栓的熒光圖像；（D）頸動(dòng)脈血栓熒光強(qiáng)度的定量分析；（E,F）MPB-NO-UK@PM和MPB-NO-UK的半衰期

（7）MPB-NO-UK@PM在體光熱效應(yīng)及光聲成像

納米復(fù)合物光熱效應(yīng)在光熱溶栓等應(yīng)用中重要。大鼠模型評(píng)估顯示，808 nm 激光照射下，MPB - NO - UK 和 MPB - NO - UK@PM 組血栓區(qū)域升溫超 PBS 對(duì)照組和僅激光組，且 MPB - NO - UK@PM 組更明顯（圖7A, B）。注射10分鐘后，光聲成像檢測(cè)到靶向和非靶向組右頸動(dòng)脈血栓PA信號(hào)，靶向組更強(qiáng)（圖 7C）。定量分析顯示兩組 PA 信號(hào)60分鐘達(dá)峰值、90分鐘下降（圖 7D）。

圖7. MPB-NO-UK@PM在體內(nèi)的光熱效應(yīng)和光聲成像。（A）近紅外照射后右頸動(dòng)脈血栓的熱圖像。（B）近紅外照射后相應(yīng)的溫度變化曲線。（C）不同時(shí)間右頸動(dòng)脈血栓的光聲圖像。（D）不同時(shí)間PA強(qiáng)度的定量分析

（8）體內(nèi)溶栓治療

MPB-NO-UK@PM聯(lián)合NIR治療組的血栓殘留面積最低（25.6 ± 3.7%），顯著優(yōu)于其他所有處理組（圖8A, D），體現(xiàn)了協(xié)同溶栓作用。該納米藥物還表現(xiàn)出良好的抗氧化和抗炎作用，能有效清除ROS并降低IL-6和TNF-α表達(dá)（圖8B, E, F, G）。MPB-NO-UK@PM聯(lián)合NIR照射可顯著抑制血栓形成，殘留血栓面積僅為14.81 ± 13.7%，優(yōu)于UK及單獨(dú)的MPB-NO-UK@PM組（圖8H, I），證實(shí)了其NIR誘導(dǎo)的NO釋放具有顯著的抗血栓和預(yù)防再聚集作用。

圖8.體內(nèi)溶栓治療和預(yù)防。（A）相應(yīng)治療后24 h動(dòng)脈粥樣硬化血栓H&E染色。（B）相應(yīng)治療后動(dòng)脈粥樣硬化血栓DHE染色。（C）動(dòng)脈血栓治療分組。（D）相應(yīng)治療后血栓閉合率定量分析。（E）相應(yīng)治療后ROS定量分析。（F）相應(yīng)處理后頸動(dòng)脈中IL-6的免疫熒光染色。（G）相應(yīng)處理后頸動(dòng)脈中TNF-α的免疫熒光染色。（H）血栓預(yù)防實(shí)驗(yàn)后頸動(dòng)脈的H&E染色。（I）血栓預(yù)防實(shí)驗(yàn)后血栓面積的定量分析