IF：26.8《AM》南昌大學(xué)萬文兵：基于負(fù)載MnCO微球的礦化蓮花莖的生物啟發(fā)免疫調(diào)節(jié)支架加速骨再生
專欄：學(xué)術(shù)前沿
發(fā)布日期：2025-08-21
作者：
臨床上，由嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除或先天畸形等造成的大段骨缺損修復(fù)仍是棘手難題。傳統(tǒng)自體或同種骨移植因供體有限、并發(fā)癥多而受限；骨組織工程雖發(fā)展出多種支架，但骨微環(huán)境中免疫—骨細(xì)胞失衡常誘發(fā)慢性炎癥，導(dǎo)致骨吸收和愈合失敗。因此，亟需一種既具備力學(xué)支撐又能主動(dòng)調(diào)節(jié)免疫、誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化以維持骨穩(wěn)態(tài)的新型仿生支架。
針對(duì)上述問題，南昌大學(xué)萬文兵團(tuán)隊(duì)受天然骨“致密-多孔”分層結(jié)構(gòu)啟發(fā)，構(gòu)建了礦化脫細(xì)胞蓮莖（MDL）與負(fù)載碳酸錳的介孔聚多巴胺微球（MM@MDL3）復(fù)合支架。該支架可持續(xù)釋放CO和Mn2?，協(xié)同促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化、抑制炎癥，并通過BMP-2/SMAD/RUNX-2通路顯著誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。大鼠顱骨缺損實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MM@MDL3可顯著增加新生骨體積、促進(jìn)血管長(zhǎng)入并減少破骨細(xì)胞生成，展現(xiàn)出修復(fù)大段骨缺損的臨床轉(zhuǎn)化潛力。該文章于2025年7月2日以《Bioinspired Immunomodulatory Scaffold Based on Mineralized Lotus Stalks Laden with MnCO Microspheres for Accelerated Bone Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI: 10.1002/adma.202502919）。
（1）空心介孔聚多巴胺藥物遞送系統(tǒng)的制備與表征
MnCO@mPDA顆粒成功構(gòu)建：SEM（圖1B）示mPDA多孔結(jié)構(gòu)被填充；TEM與EDX（圖1E）證實(shí)C、O、N外新增Mn；粒徑由mPDA的255 nm增至295 nm（圖1C），Zeta電位由?0.39 mV降至?22.17 mV（圖1D）。FTIR在2000 cm?1出現(xiàn)碳酸錳峰（圖1F），XPS于641.4 eV處檢出Mn峰（圖1G）。CO釋放動(dòng)力學(xué)（圖1H）：隨時(shí)間延長(zhǎng)，血紅蛋白430 nm吸收下降，碳氧血紅蛋白410 nm吸收上升。細(xì)胞相容性（圖1I）：rBMSCs在0–50 μg mL?1存活率>90%，50 μg mL?1為最佳工作濃度；12.5–50 μg mL?1連續(xù)5天無毒性，100 μg mL?1第3天起出現(xiàn)顯著毒性。
圖1.多聚多巴胺藥物遞送系統(tǒng)的制備和表征。（A） 空心介孔聚多巴胺微球制備過程的示意圖。（B） SEM/EDX 圖像顯示了具有和沒有羰基錳負(fù)載的介孔多巴胺微球的形態(tài)，以及相應(yīng)的元素組成分析。（C） 介孔聚多巴胺微球的尺寸分布曲線。（D） 錳羰基負(fù)載前后介孔聚多巴胺微球的 Zeta 電位測(cè)量。（E） 元素分布圖 （TEM），顯示負(fù)載的介孔聚多巴胺微球內(nèi)錳的分布。（F） 聚多巴胺、羰基錳和負(fù)載羰基錳的介孔多巴胺微球 （MnCO@mPDA） 的 FTIR 光譜。（G） MnCO@mPDA 的 XPS 分析。（H） 紫外-可見吸收檢測(cè) CO 釋放。（I） 與不同濃度 MnCO@mPDA 共培養(yǎng) 1、3 和 5 天的 BMSCs 的細(xì)胞相容性測(cè)定。p < 0.001
（2）復(fù)合脫細(xì)胞蓮花莖支架的制備與表征
圖2A示復(fù)合脫細(xì)胞蓮莖支架制備示意；圖2B為L(zhǎng)otus、DL、MDL、MDL-3、MM@MDL-3實(shí)物；圖2C、2D顯示DL已去除>95% DNA與蛋白；圖2E給出DL孔隙率88.66±1.76%，礦化后降至67.33±0.88%；圖2F測(cè)得大孔徑2000 μm、小孔徑130 μm；圖2G–H證實(shí)所有支架具大孔及小管結(jié)構(gòu)；圖2I示縱向定向垂直通道；圖2J–M示DL壓應(yīng)力0.49±0.02 MPa、拉應(yīng)力0.20±0.05 MPa，礦化后分別升至8.54±0.36 MPa與1.24±0.03 MPa，三次凍融后分別增至12.04±0.48 MPa與1.41±0.02 MPa，MnCO@mPDA的加入使應(yīng)力略再提高。
圖2 功能化蓮花葉柄的表征。（A）制備流程示意圖；（B）各階段實(shí)物照片；（C,D）DL脫細(xì)胞后DNA與蛋白殘留量；（E,F）孔隙率及孔徑；（G,H）橫截面與縱向多孔通道形貌；（I）通道取向分析；（J–M）壓縮與拉伸力學(xué)性能
（3）復(fù)合脫細(xì)胞蓮莖支架干細(xì)胞招募實(shí)驗(yàn)和體外成骨實(shí)驗(yàn)
圖3A示MM@MDL3支架內(nèi)BMSCs沿縱向通道遷移，第1天聚集0–100 μm，第3天達(dá)200–400 μm，第7天深入500 μm，各深度細(xì)胞密度均高于DL、MDL、MDL3。圖3B顯示所有樣本ALP陽(yáng)性，MM@MDL3于7 d和14 d染色最深；圖3C、D定量ALP活性與染色一致。圖3E–G示ARS鈣結(jié)節(jié)染色紅色隨培養(yǎng)加深，MM@MDL3礦化最高。RT-qPCR表明，與DL相比，MDL、MDL3、MM@MDL3在各時(shí)間點(diǎn)Runx2、Col I、OPN表達(dá)均上調(diào)，以MM@MDL3增幅最大。
圖3 MM@MDL3對(duì)BMSC遷移與成骨分化的影響。（A）共培養(yǎng)1、3、7 D后BMSC垂直遷移的3D重建；（B）7 D與14 D的ALP染色；（C,D）對(duì)應(yīng)ALP活性定量；（E）7 D與14 D的ARS染色；（F,G）鈣結(jié)節(jié)定量
（4）復(fù)合脫細(xì)胞蓮莖支架的體內(nèi)成骨評(píng)價(jià)
圖4A示術(shù)后4、8周Micro-CT重建及矢狀面影像，MDL、MDL3、MM@MDL3組新骨覆蓋率高于對(duì)照與DL；圖4B–D量化顯示MM@MDL3的BV/TV最高、Tb.Th最大、Tb.Sp最小。圖S9A的HE染色及定量表明MM@MDL3有機(jī)骨基質(zhì)最多；圖4E的三色染色與定量證實(shí)其膠原基質(zhì)亦最高。圖4F的CD31免疫熒光顯示MM@MDL3血管新生最顯著。
圖4 MM@MDL3對(duì)骨再生的影響。（A）術(shù)后1、2月Micro-CT重建及橫截面影像；（B）BV/TV定量；（C）Tb.Sp；（D）Tb.Th；（E）Masson三色染色示膠原沉積；（F）CD31免疫組化示血管新生
（5）復(fù)合脫細(xì)胞蓮莖支架的定向骨生長(zhǎng)能力
如圖5A所示，該示意圖說明了功能化蓮花莖用于頜骨缺陷修復(fù)的植入過程。紅色箭頭指示細(xì)胞遷移的方向。在對(duì)骨缺陷模型脫鈣股骨的三色染色圖像進(jìn)行定向分析中，對(duì)照組顯示再生骨中的膠原蛋白矩陣取向混亂。相比之下，DL、MDL、MDL 3和MM@MDL 3組表現(xiàn)出膠原蛋白矩陣的有序定向生長(zhǎng)，垂直于骨缺陷方向（圖5 B）。
圖5 功能化蓮花葉柄引導(dǎo)定向骨基質(zhì)沉積。（A）長(zhǎng)骨缺損修復(fù)示意圖，紅色箭頭示細(xì)胞遷移方向；（B）術(shù)后4周股骨缺損區(qū)三色染色，黑色箭頭示骨基質(zhì)取向；（C）三色染色偽彩圖示再生骨基質(zhì)定向；（D）各組再生基質(zhì)角度分布
（6）復(fù)合脫細(xì)胞蓮莖支架的抗炎能力
圖6A–C示RAW264.7細(xì)胞經(jīng)MM@MDL3提取物處理后CD206↑、NOS↓，提示M2極化；圖6D、E顯示MM@MDL3使ROS熒光最低，自由基清除率61.87±1.63%。圖6F–H示術(shù)后4周植入?yún)^(qū)CD206↑、CD86↓，MM@MDL3 M2表達(dá)最高；圖6I示其M1/M2比值最低。圖6J–L GO與GOBP分析均顯示MM@MDL3上調(diào)適應(yīng)性免疫、吞噬及趨化相關(guān)通路。
圖6 MM@MDL3對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。（A）RAW264.7極化示意；（B,C）CD86與CD206表達(dá)；（D,E）L929抗氧化；（F–H）缺損區(qū)M1/M2巨噬細(xì)胞；（I）M1/M2比值；（J）GO富集；（K,L）GOBP富集
（7）復(fù)合脫細(xì)胞蓮莖支架的成骨機(jī)制研究
圖7A–D示與對(duì)照及DL相比，MDL、MDL3、MM@MDL3組BMP2、SMAD、RUNX2熒光增強(qiáng)，MM@MDL3表達(dá)最高；圖7E–J示術(shù)后4周MM@MDL3組C-FOS、RANKL下調(diào)，HIF-1β、P85上調(diào)，提示其經(jīng)BMP2/SMAD/RUNX2促成骨，并藉PI3K/Akt/HIF-1β抑破骨。
圖7 MM@MDL3對(duì)骨修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)的影響。（A）BMP2、SMAD、RUNX2免疫熒光；（B–D）RANKL、CFOS免疫熒光；（E–G）P85、HIF-1Α免疫熒光
圖8A示PCA區(qū)分MM@MDL3與對(duì)照；圖8B火山圖列上調(diào)3301、下調(diào)3429基因；圖8C–E GO與GOBP示細(xì)胞粘附及成骨通路上調(diào)；圖8F、G示血管生成、礦化、骨重塑增強(qiáng)；圖8H網(wǎng)絡(luò)圖確認(rèn)骨形態(tài)發(fā)生、成骨分化富集；圖8I熱圖列Ctsk、Tnn、Gpnmb、Sphk1上調(diào)。
圖8 MM@MDL3的RNA-SEQ分析。（A）PCA；（B）火山圖；（C）細(xì)胞行為GO；（D,E）細(xì)胞粘附與骨化GOBP；（F）骨重塑GO；（G）血管生成GO；（H）CYTOSCAPE/CLUEGO網(wǎng)絡(luò)；（I）差異基因熱圖
本研究構(gòu)建的MM@MDL3支架借助有序通道快速募集修復(fù)細(xì)胞，并通過持續(xù)釋放CO與Mn2?誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，從而在抑制破骨細(xì)胞活性的同時(shí)顯著促進(jìn)血管生成與成骨，實(shí)現(xiàn)骨缺損高效再生；該策略為臨床骨修復(fù)提供了可行方案。后續(xù)需系統(tǒng)闡明支架降解動(dòng)力學(xué)、長(zhǎng)期安全性及MnCO潛在毒性，并進(jìn)一步優(yōu)化組分與遞送系統(tǒng)，以推動(dòng)臨床轉(zhuǎn)化。
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