哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Howard L. Weiner教授團(tuán)隊(duì)受粘膜免疫系統(tǒng)啟發(fā)，研究了鼻內(nèi)給藥抗CD3單克隆抗體（aCD3 mAb）治療TBI。研究發(fā)現(xiàn)，該方法可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），這些細(xì)胞遷移到大腦與小膠質(zhì)細(xì)胞接觸，通過(guò)IL-10依賴機(jī)制減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的慢性炎癥并調(diào)節(jié)其吞噬功能。阻斷IL-10受體會(huì)消除aCD3 mAb的益處，而將IL-10產(chǎn)生型Treg細(xì)胞移植到TBI小鼠中可恢復(fù)這些效果，表明鼻內(nèi)給藥aCD3 mAb是治療TBI的潛在新策略。該文章于2025年02月27日以《Nasal anti-CD3 monoclonal antibody ameliorates traumatic brain injury, enhances microglial phagocytosis and reduces neuroinflammation via IL-10-dependent crosstalk》為題發(fā)表于《Nature Neuroscience》（DOI：10.1038/s41593-025-01877-7）。

（1）經(jīng)鼻 aCD3 mAb 改善 TBI 后的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)結(jié)局

研究采用CCI模型評(píng)估鼻內(nèi)給藥抗CD3單克隆抗體（aCD3）對(duì)TBI的治療效果。實(shí)驗(yàn)分為傷后4 - 6小時(shí)立即給藥、傷后3天早期給藥和傷后14天延遲給藥，持續(xù)治療1個(gè)月。結(jié)果顯示，立即給藥組在運(yùn)動(dòng)功能和協(xié)調(diào)性、空間記憶方面顯著改善，焦慮行為減少；早期給藥組運(yùn)動(dòng)功能和協(xié)調(diào)性、空間記憶改善，但焦慮行為未改善；延遲給藥組未見(jiàn)改善。在更嚴(yán)重的TBI模型中，雄性、雌性小鼠aCD3治療均改善運(yùn)動(dòng)功能和協(xié)調(diào)性，部分恢復(fù)空間記憶。雄性小鼠嚴(yán)重TBI后焦慮行為減少，而雌性小鼠無(wú)焦慮表型，無(wú)法評(píng)估aCD3對(duì)焦慮行為的益處。結(jié)果表明，鼻內(nèi)給藥aCD3可改善中度和重度TBI的行為學(xué)結(jié)果，且對(duì)雄性小鼠效果更顯著。

圖1 鼻內(nèi)給藥aCD3治療方案及行為學(xué)測(cè)試結(jié)果。（a）治療方案示意圖；（b）立即治療組行為學(xué)測(cè)試結(jié)果（轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)、探試實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估焦慮行為），采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析（MWM測(cè)試）和單因素方差分析（其他測(cè)試），數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；（c）傷后7天MRI腦損傷體積測(cè)量，采用雙側(cè)非配對(duì)t檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，紅色虛線指示損傷區(qū)域；（d）傷后30天H&E染色腦切片損傷體積測(cè)量，采用雙側(cè)非配對(duì)t檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，比例尺1000 μm；（e）傷后7天神經(jīng)元死亡免疫熒光染色（DAPI藍(lán)、TUNEL紅、7-AAD綠），比例尺200 μm（放大圖500 μm），TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)ImageJ定量，采用雙側(cè)非配對(duì)t檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；（f）傷后30天小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1免疫熒光染色（DAPI藍(lán)、Iba-1紅），比例尺200 μm（放大圖500 μm），Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)ImageJ定量，采用單因素方差分析分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；（g）傷后1天血清生物標(biāo)志物檢測(cè)，采用Quanterix SiMoA和V-Plex炎癥因子檢測(cè)，采用單因素方差分析分析，數(shù)據(jù)以箱線圖（最小值、最大值、四分位距、中位數(shù)）表示。所有數(shù)據(jù)均為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的生物學(xué)重復(fù)

（2）CD3單克隆抗體鼻內(nèi)給藥改善TBI神經(jīng)病理過(guò)程

研究通過(guò)多種方法評(píng)估了鼻內(nèi)給藥aCD3對(duì)TBI引發(fā)的神經(jīng)病理學(xué)結(jié)果的影響。傷后7天，3T MRI測(cè)量顯示鼻內(nèi)給藥aCD3組腦實(shí)質(zhì)損傷體積較TBI - iso對(duì)照組減少。傷后1個(gè)月，H&E染色測(cè)量的損傷體積也顯示aCD3治療組較TBI - iso對(duì)照組減少。鼻內(nèi)給藥aCD3在傷后3天改善了血腦屏障（BBB）完整性，降低了TBI - iso對(duì)照組同側(cè)半球的腦水腫百分比。TUNEL染色檢測(cè)到的細(xì)胞死亡在鼻內(nèi)給藥aCD3治療后減少。傷后30天，CCI增加了小膠質(zhì)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的激活（Iba - 1染色），而鼻內(nèi)給藥aCD3在雄鼠中減少了這種激活。與對(duì)照組相比，鼻內(nèi)給藥aCD3組的幾種TBI血清生物標(biāo)志物減少，而抗炎細(xì)胞因子IL - 10增加。這些結(jié)果表明，鼻內(nèi)給藥aCD3改善了TBI小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，與神經(jīng)病理學(xué)和血清生物標(biāo)志物所顯示的增強(qiáng)的組織完整性相關(guān)。

（3）aCD3單克隆抗體鼻內(nèi)給藥增加TBI后Treg細(xì)胞數(shù)量，改變先天性和適應(yīng)性免疫格局

研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，鼻內(nèi)給藥aCD3在傷后1天增加頸淋巴結(jié)（cLNs）中總CD4+ T細(xì)胞和CD4+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的比例，傷后2天增加腦膜中這些細(xì)胞的總數(shù)。鼻內(nèi)給藥aCD3在傷后3天和7天增加大腦中CD4+ T細(xì)胞的總數(shù)，并在傷后30天內(nèi)增加CD4+FoxP3+ Treg細(xì)胞。與TBI - iso組相比，未觀察到表達(dá)潛伏相關(guān)肽（LAP）的CD4+ T細(xì)胞增加。結(jié)果表明，鼻內(nèi)給藥aCD3通過(guò)擴(kuò)大Treg細(xì)胞來(lái)控制TBI后的神經(jīng)炎癥。

（4）aCD3單克隆抗體鼻內(nèi)給藥誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特征

鼻內(nèi)給藥aCD3在傷后30天內(nèi)增加了CD4+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）。對(duì)CCI后7天從假手術(shù)和受傷小鼠的腦周損傷組織和血液中分離的CD4+FoxP3(GFP)+ Treg細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序分析。主成分分析（PCA）顯示，TBI后腦內(nèi)FoxP3 Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征與血液中的顯著不同。與假手術(shù)小鼠的血液Treg細(xì)胞相比，TBI小鼠腦內(nèi)浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞中多種免疫調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)因子基因表達(dá)增加。鼻內(nèi)給藥aCD3處理的小鼠血液中的FoxP3 Treg細(xì)胞具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組特征，涉及Treg細(xì)胞增殖和穩(wěn)態(tài)以及Treg細(xì)胞功能的基因上調(diào)。通路分析（IPA）顯示，與TBI - iso FoxP3 Treg細(xì)胞相比，aCD3誘導(dǎo)的FoxP3 Treg細(xì)胞中IL - 10是最主要的上游激活調(diào)節(jié)因子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TBI和鼻內(nèi)給藥aCD3處理的小鼠腦內(nèi)浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞中，免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。此外，aCD3誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞中，免疫調(diào)節(jié)、吞噬調(diào)節(jié)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及其他Treg細(xì)胞免疫抑制功能所需基因的表達(dá)進(jìn)一步增加?；蚣患治觯℅SEA）和通路分析（IPA）顯示，與假手術(shù)對(duì)照組和TBI - iso組相比，TBI - aCD3處理的小鼠腦內(nèi)Treg細(xì)胞中涉及遷移、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、吞噬、神經(jīng)發(fā)生、穩(wěn)態(tài)和分泌功能的生物通路富集。通路分析（IPA）識(shí)別出IL - 10和Stat3是TBI小鼠腦內(nèi)aCD3處理的Treg細(xì)胞中最主要的上游激活調(diào)節(jié)因子。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與TBI - iso對(duì)照組相比，aCD3處理的小鼠腦內(nèi)Treg細(xì)胞中IL - 10表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明，外周和中樞Treg細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特征，與鼻內(nèi)給藥aCD3治療TBI后的改善相關(guān)。

（5）aCD3單克隆抗體鼻內(nèi)給藥調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)

鼻內(nèi)給藥aCD3增加了FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）向腦膜和CCI損傷部位的遷移，這些細(xì)胞在損傷后與小膠質(zhì)細(xì)胞樹(shù)突密切接觸。小膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的RNA測(cè)序分析顯示，在傷后7天，TBI - iso和TBI - aCD3組的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征相似，但到傷后30天，TBI - aCD3組的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征向假手術(shù)對(duì)照組表型轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為下調(diào)促炎基因（如Il6、Il18）和上調(diào)穩(wěn)態(tài)基因（如Tgfbr2、Mertk）。在傷后7天，鼻內(nèi)給藥aCD3處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中，穩(wěn)態(tài)和感知相關(guān)基因（如Cd33、Lag3）表達(dá)增加，且下調(diào)促炎關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Cd14。傷后30天，aCD3處理增加了TGF - β信號(hào)通路基因表達(dá)（如Smad3、Tgfbr1），并下調(diào)了細(xì)胞因子受體和模式識(shí)別受體相關(guān)基因（如Tnfrsf17、Cd74）?；蚣患治觯℅SEA）表明，在傷后7天，TBI - iso組上調(diào)氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡相關(guān)通路，而TBI - aCD3組在這些通路中的基因上調(diào)較少，且在抗炎IL - 10產(chǎn)生和吞噬相關(guān)通路中基因上調(diào)更多。傷后30天，TBI - iso組在促炎機(jī)制和細(xì)胞殺傷通路中基因表達(dá)富集，而TBI - aCD3組在這些通路中的基因上調(diào)較少，且在吞噬和細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)通路中基因上調(diào)更多。分析傷后30天的炎癥反應(yīng)基因和疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞（DAMs）、神經(jīng)退行性小膠質(zhì)細(xì)胞（MGnDs）特征基因發(fā)現(xiàn)，TBI - iso小膠質(zhì)細(xì)胞具有促炎反應(yīng)和DAM或MGnD特征，而aCD3處理的小鼠中這些基因表達(dá)下調(diào)，接近假手術(shù)組水平。定量PCR（RT - qPCR）顯示，鼻內(nèi)給藥aCD3在傷后7天增加小膠質(zhì)細(xì)胞和腦組織中抗炎細(xì)胞因子Il10的表達(dá)，并在傷后30天減少促炎標(biāo)志物表達(dá)，同時(shí)上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Bdnf）。這些結(jié)果表明，鼻內(nèi)給藥aCD3使小膠質(zhì)細(xì)胞從病理性的、疾病相關(guān)表型轉(zhuǎn)變?yōu)橛幸娴?、穩(wěn)態(tài)表型。

（6）鼻腔 aCD3 以 IL-10 依賴性方式增加小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用

TBI - aCD3處理的小鼠在傷后7天吞噬相關(guān)生物學(xué)通路顯著上調(diào)，且在傷后30天多種關(guān)鍵小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬調(diào)節(jié)因子（Mertk、Sirpa和Tlr4）表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)在傷后6天和7天分別注射標(biāo)記的凋亡神經(jīng)元或PBS，并在注射后16小時(shí)和4小時(shí)檢測(cè)，結(jié)果顯示aCD3處理的小鼠在注射后4小時(shí)和16小時(shí)的吞噬能力均高于TBI - iso組。對(duì)傷后7天的吞噬性和非吞噬性小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序分析，結(jié)果顯示吞噬性TBI - aCD3小膠質(zhì)細(xì)胞在注射后4小時(shí)表現(xiàn)出獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組特征，涉及多種關(guān)鍵吞噬基因的上調(diào)。與非吞噬性TBI - iso小膠質(zhì)細(xì)胞相比，吞噬性TBI - aCD3小膠質(zhì)細(xì)胞在識(shí)別和吞噬凋亡細(xì)胞及碎片（Mertk、Mrc1、Abca1、Lrp1和Stab1）、消化降解吞噬物（Rab27a、Smcr8、Clec16a和Vps8）、脂質(zhì)代謝（Apoc1、Olr1和Ldlr）、細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)（Myo1e）和調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬（Tspo、Qk和Pik3cg）的基因表達(dá)增加?；蚣患治觯℅SEA）顯示，與非吞噬性TBI - iso小膠質(zhì)細(xì)胞相比，吞噬性TBI - aCD3小膠質(zhì)細(xì)胞在吞噬相關(guān)通路（包括內(nèi)吞、模式識(shí)別和細(xì)胞遷移）中顯著富集。此外，與吞噬性TBI - iso小膠質(zhì)細(xì)胞相比，吞噬性TBI - aCD3小膠質(zhì)細(xì)胞在抗原呈遞和IL - 10通路的上調(diào)更為顯著。通路分析（IPA）顯示，IL - 10是aCD3處理的吞噬性小膠質(zhì)細(xì)胞中最重要的調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路。在傷后16小時(shí)，也觀察到類似的吞噬機(jī)制相關(guān)基因和通路的上調(diào)，且吞噬性TBI - aCD3小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出更穩(wěn)態(tài)、更少炎癥（疾病相關(guān)）的特征。使用IL - 10基因敲除（KO）小鼠重復(fù)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示IL - 10 KO小鼠中TBI - aCD3小膠質(zhì)細(xì)胞在注射后4小時(shí)的吞噬能力顯著降低，且與野生型（WT）TBI - iso小膠質(zhì)細(xì)胞相比，IL - 10 KO小鼠的TBI - iso小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力顯著降低。這些結(jié)果表明，鼻內(nèi)給藥aCD3通過(guò)IL - 10依賴的方式增強(qiáng)了小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬機(jī)制。

圖4 小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的表征及鼻內(nèi)給藥aCD3的影響。（a）傷后7天小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬相關(guān)基因的熱圖，基因通過(guò)DESeq2分析（雙側(cè)似然比檢驗(yàn)，每組n = 4只小鼠）鑒定，F(xiàn)DR校正P < 0.05的基因用星號(hào)表示；（b）吞噬功能實(shí)驗(yàn)示意圖；（c）傷后7天損傷部位的免疫熒光染色（凋亡神經(jīng)元藍(lán)、P2ry12紅），顯示P2ry12吞噬凋亡神經(jīng)元，比例尺100 μm（放大圖50 μm）；（d）注射標(biāo)記的凋亡神經(jīng)元后4小時(shí)的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以箱線圖表示，每組n = 5只小鼠，采用雙側(cè)非配對(duì)t檢驗(yàn)分析；（e）傷后7天及凋亡神經(jīng)元注射后4小時(shí)，吞噬性（+P）和非吞噬性（-P）小膠質(zhì)細(xì)胞的差異表達(dá)基因（DEGs）聚類熱圖（DESeq2分析，雙側(cè)似然比檢驗(yàn)，每組n = 3 - 4只小鼠，F(xiàn)DR校正P < 0.05）；（f）與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬及相關(guān)功能相關(guān)的基因在TBI - iso（+P）與TBI - iso（-P）以及TBI - aCD3（+P）與TBI - iso（-P）比較中的log2（倍數(shù)變化）條形圖；（g）基于上述比較的基因集富集分析（GSEA），q值 < 0.05的富集項(xiàng)用星號(hào)表示；（h）與吞噬性TBI - iso小膠質(zhì)細(xì)胞相比，吞噬性TBI - aCD3小膠質(zhì)細(xì)胞的DEGs的通路分析中選擇的頂級(jí)典型通路；（i）TBI - aCD3（+P）與TBI - iso（-P）比較中預(yù)測(cè)的上游調(diào)節(jié)因子；（j）與（b）相似設(shè)計(jì)的吞噬實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以箱線圖表示，每組n = 5只小鼠，采用單因素方差分析分析。所有數(shù)據(jù)均為生物學(xué)重復(fù)，代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)

（7）鼻腔 aCD3 通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞中的 IL-10/IL-10R 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改善 TBI 預(yù)后

在傷后7天，TBI - aCD3組小膠質(zhì)細(xì)胞的IL - 10細(xì)胞因子基因表達(dá)顯著上調(diào)。鼻內(nèi)給藥aCD3誘導(dǎo)分泌IL - 10的Treg細(xì)胞，并在損傷部位的小膠質(zhì)細(xì)胞和腦組織中增加IL - 10表達(dá)。通過(guò)腹腔注射抗IL - 10R（aIL - 10R）阻斷抗體，每3天一次，研究假手術(shù) - iso、TBI - iso、TBI - aCD3和TBI - aCD3 + aIL - 10R組的行為學(xué)結(jié)果和血腦屏障（BBB）破壞情況。結(jié)果顯示，TBI - aCD3組在BBB破壞以及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能、空間記憶和焦慮樣行為方面的改善被IL - 10R阻斷抵消。RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，傷后1個(gè)月，鼻內(nèi)給藥aCD3對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用被IL - 10阻斷，小膠質(zhì)細(xì)胞熱圖顯示TBI - aCD3 + aIL - 10R組表現(xiàn)出更促炎的轉(zhuǎn)錄組特征，且穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物表達(dá)減少。使用IL - 10Rflox/floxTmem119CreETR2條件性敲除（KO）小鼠及其同窩對(duì)照小鼠，研究小膠質(zhì)細(xì)胞IL - 10R敲除對(duì)行為學(xué)和小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)他莫昔芬處理的TBI - aCD3 - IL - 10Rflox/floxTmem119CreETR2小鼠表現(xiàn)出更差的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知結(jié)果以及降低的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力。這些結(jié)果表明，IL - 10/IL - 10R信號(hào)在增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力和改善TBI疾病中起關(guān)鍵作用。

（8）鼻腔 aCD3 誘導(dǎo)的 CD4⁺FoxP3⁺Treg細(xì)胞改善神經(jīng)炎癥和 TBI 結(jié)果

鼻內(nèi)給藥aCD3在傷后3天至30天增加了損傷部位的FoxP3+ Treg細(xì)胞，并通過(guò)減少小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥改善了TBI的行為學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)結(jié)果。過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，接受aCD3處理小鼠的CD4+FoxP3+ Treg細(xì)胞的小鼠在傷后7天表現(xiàn)出改善的運(yùn)動(dòng)功能和協(xié)調(diào)性，并恢復(fù)了空間記憶。對(duì)TBI - aCD3 - FoxP3+、TBI - iso - FoxP3+和TBI - aCD3 - FoxP3? GFP組小鼠損傷側(cè)半球的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質(zhì)細(xì)胞與其他組相比具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組特征?；蚣患治觯℅SEA）顯示，與TBI - aCD3 - FoxP3?小膠質(zhì)細(xì)胞相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質(zhì)細(xì)胞下調(diào)了包括干擾素（IFN）γ和IFNα在內(nèi)的多種促炎通路。通路分析（IPA）揭示IL - 10Ra是TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質(zhì)細(xì)胞中最重要的上游激活調(diào)節(jié)因子之一，而IL - 1b是最重要的上游抑制調(diào)節(jié)因子之一。與TBI - iso - FoxP3+小膠質(zhì)細(xì)胞相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質(zhì)細(xì)胞中IFNγ是最顯著下調(diào)的調(diào)節(jié)因子之一。定量PCR（RT - qPCR）顯示，與另外兩組相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子減少，穩(wěn)態(tài)和抗炎細(xì)胞因子表達(dá)增加。接受aCD3處理小鼠的CD4+FoxP3+ Treg細(xì)胞的小鼠在傷后7天增加了小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力。這些結(jié)果表明，F(xiàn)oxP3+ Treg細(xì)胞在增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力和改善TBI疾病中起關(guān)鍵作用。

圖6 Treg細(xì)胞對(duì)TBI后行為學(xué)和小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的影響。（a）過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)時(shí)間線；（b）轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和Y迷宮測(cè)試結(jié)果，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析分析；（c）傷后7天小膠質(zhì)細(xì)胞的差異表達(dá)基因（DEGs）聚類熱圖，基因通過(guò)DESeq2分析（雙側(cè)Wald檢驗(yàn)，每組n = 3只小鼠，F(xiàn)DR校正P < 0.05）鑒定，聚類用基因本體生物學(xué)過(guò)程（GOBP）富集項(xiàng)（q值 < 0.05）注釋；（d）基因集富集分析（GSEA）分析TBI - iso FoxP3與TBI - aCD3 - FoxP3?以及TBI - aCD3 - FoxP3與TBI - aCD3 - FoxP3?的比較，q值 < 0.05的富集項(xiàng)用星號(hào)表示；（e）TBI - aCD3 - FoxP3與TBI - aCD3 - FoxP3?比較的預(yù)測(cè)上游調(diào)節(jié)因子（通路分析）；（f）TBI - aCD3 - FoxP3與TBI - iso FoxP3比較的基因集富集分析；（g）TBI - aCD3 - FoxP3與TBI - iso FoxP3比較的預(yù)測(cè)上游調(diào)節(jié)因子（通路分析）；（h）傷后7天損傷側(cè)半球小膠質(zhì)細(xì)胞的定量PCR分析，以GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析分析；（i）與圖4b相似設(shè)計(jì)的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以箱線圖（最小值、最大值、四分位距、中位數(shù)）表示，采用單因素方差分析分析；（j）小膠質(zhì)細(xì)胞和Treg細(xì)胞共培養(yǎng)示意圖；（k）小膠質(zhì)細(xì)胞的定量PCR分析，以GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析分析。所有數(shù)據(jù)均為生物學(xué)重復(fù)，代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)

（9）CD4⁺Foxp3⁺Treg細(xì)胞在體外抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥和穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物

采用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，從小鼠CCI損傷后24小時(shí)的損傷側(cè)半球分離小膠質(zhì)細(xì)胞，并從接受CCI和鼻內(nèi)給藥aCD3或同型對(duì)照處理7天的小鼠脾臟中分離Treg細(xì)胞。共培養(yǎng)72小時(shí)后對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行定量PCR分析，結(jié)果顯示，與TBI - iso組相比，TBI - aCD3組小膠質(zhì)細(xì)胞中抗炎和穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物（Il10、Cx3cr1和Cd206）增加，促炎標(biāo)志物Il1b減少，這與傷后7天的體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。此外，通過(guò)體外阻斷IL - 10，這種效應(yīng)消失，這也與體內(nèi)IL - 10中和后的觀察結(jié)果一致。

（10）產(chǎn)生IL-10的Treg細(xì)胞促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬、改善神經(jīng)炎癥及功能預(yù)后

鼻內(nèi)給藥aCD3處理小鼠的FoxP3 Treg細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移可改善TBI，且IL - 10在其中發(fā)揮重要作用。利用FoxP3 - DTR轉(zhuǎn)基因小鼠耗竭FoxP3 Treg細(xì)胞，白喉毒素（DT）在CCI前3天注射，并每3天重復(fù)一次，直至CCI或假手術(shù)后7天。結(jié)果表明，F(xiàn)oxP3 Treg細(xì)胞的耗竭惡化了運(yùn)動(dòng)功能，加劇了小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥，并增加了促炎小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（Il1b、Tnf、Il6和Il18）的表達(dá)。FoxP3 Treg細(xì)胞的耗竭降低了小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬死亡神經(jīng)元的能力。使用10BiT.FoxP3GFP雙重報(bào)告系統(tǒng)分離IL - 10+和IL - 10? Treg細(xì)胞，并將這些細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至FoxP3耗竭小鼠中，觀察到IL - 10+ Treg細(xì)胞與IL - 10? Treg細(xì)胞相比，改善了運(yùn)動(dòng)功能和空間記憶，降低了促炎標(biāo)志物的表達(dá)，并且增強(qiáng)了小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)死亡神經(jīng)元的吞噬能力。因此，IL - 10在鼻內(nèi)給藥aCD3誘導(dǎo)的FoxP3 Treg細(xì)胞對(duì)TBI的有益效果中起關(guān)鍵作用。