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細胞可以通過全細胞運動，如擴散、遷移或體積膨脹，在三維空間上改變其局部生態(tài)位。這些行為持續(xù)數(shù)小時至數(shù)天，影響包括分化在內的長期細胞命運。涉及細胞周圍生態(tài)位物理變形的細胞行為通常由涉及多個亞細胞水平信號變化的機械轉導途徑介導，從ECM -細胞膜界面-細胞骨架和細胞核。盡管黏附配體和細胞骨架在細胞機械傳感中的作用已被廣泛研究，但細胞核的機械傳感作用尚未得到廣泛研究。先前的研究報道了快速的亞細胞動力學，如細胞骨架的變化和局灶黏附，發(fā)生在秒的時間尺度。然而，對三維環(huán)境中全細胞運動的研究，如細胞擴散、遷移和體積膨脹，都集中在更長的時間尺度上，從幾小時到幾天不等。目前尚不清楚三維全細胞運動是否可以在更快的時間尺度上發(fā)生，以及這種快速的細胞運動如何影響細胞的長期命運，如分化。

針對上述問題，美國斯坦福大學楊帆團隊報告了在分鐘時間尺度上發(fā)生在滑動水凝膠中的全細胞運動，稱為細胞翻轉，其特征是三維細胞動力學和水凝膠變形，由秒到分鐘尺度的細胞骨架和核活動引起。抑制或促進間充質干細胞的細胞翻滾的研究表明，這種行為增強了向軟骨細胞的分化。此外，它還與全局染色質可及性的降低有關，而這是增強分化所必需的。細胞翻滾也發(fā)生在分化為其他譜系的過程中，其促進分化的作用在不同的水凝膠平臺上得到了驗證。研究結果表明，細胞翻滾是干細胞分化的一個額外調節(jié)因子，由快速生態(tài)位變形和核機械轉導介導。該文章于2024年9月30日以《Cell tumbling enhances stem cell differentiation in hydrogels via nuclear mechanotransduction》為題發(fā)表于《Nature Materials》上。（DOI：10.1038/s41563-024-02038-0）。

（1）MSC軟骨形成增強與細胞翻滾有關

為研究局部ECM如何調節(jié)MSC分化，研究團隊使用PEG基SG和CG系統(tǒng)評估MSC軟骨形成。SG具有可滑動的交聯(lián)結構，使細胞可根據(jù)力重新組織水凝膠網(wǎng)絡（圖1a）。SG和CG的交聯(lián)均為不可逆的共價鍵，且在細胞時間尺度上表現(xiàn)彈性（圖1c右）。通過動態(tài)光散射微觀流變學，團隊發(fā)現(xiàn)SG在局部比CG更柔軟約5倍，使細胞更易變形局部環(huán)境（圖1c左）。結果顯示，SG顯著增強了MSC軟骨形成，第21天軟骨基質沉積增加（圖1b）?；罴毎上耧@示，SG中的MSC表現(xiàn)出動態(tài)翻滾和局部快速變形，而CG中的MSC幾乎靜態(tài)（圖1d-h）。AFM測試表明，SG在變形時力響應漸進，允許更大變形，便于細胞重組局部基質并促進翻滾（圖1i-j）。

圖1. 增強的MSC軟骨形成與分鐘尺度的三維細胞翻滾有關。 a. 示意圖說明 SG 與 CG，具有移動或靜態(tài)交聯(lián)和配體。b. 代表性Safranin O染色顯示 MSCs 在 SG（頂部）和 CG（底部）中經(jīng)過 21 天的軟骨誘導后沉積 sGAG。c. 通過基于動態(tài)光散射的微流變學（左；每種條件N ?= 3 種凝膠）和本體平行板剪切流變學（右）獲得的SG和 CG 的代表性儲存和損耗模量。d-h. 細胞翻滾的特征。d. SG（頂部）和 CG（底部）中單個活細胞的延時圖像序列。e . d中SG（頂部）和 CG（底部）中相應細胞的標記水凝膠的延時圖像序列。f. SG（頂部）和 CG（底部）中單個細胞隨時間變化的疊加顏色編碼輪廓。g. 時間上細胞形狀的相關系數(shù)，比較時間t > 0時的細胞形狀?與時間t=0 時的形狀?。h. 細胞長軸的質心速度（左）和角速度（右）。i. 從 SG、CG 和 SG50:CG50 上的 AFM 點壓痕獲得的力-應變曲線（左）。從力-應變曲線得出的 SG、CG 和 SG50:CG50 中具有相同大小的力的應變（右）。 j. SG50:CG50 中的細胞翻滾（左）質心速度和長軸角速度（右）

（2）翻滾與增強的亞細胞動力學有關

考慮到細胞翻滾與快速動力學相關，研究團隊進一步探索亞細胞層級的動力學，包括外基質、細胞骨架和細胞核。通過跟蹤水凝膠中熒光珠的位移，研究團隊發(fā)現(xiàn)，與CG相比，SG中的細胞翻滾在15分鐘內引發(fā)顯著增強的細胞周圍基質變形，最大達1μm（圖2a）。由于翻滾與基質變形有關，團隊推測SG中的細胞骨架動力學更強。利用Lifeact標記的MSCs，觀察到SG中秒級的F-actin動態(tài)增強，特別是在動態(tài)突起處（圖2b-f）。進一步計算F-actin的動態(tài)面積變化，結果表明SG中的F-actin動力學顯著更高（圖2d-f）。盡管傳統(tǒng)認為細胞核主要存儲遺傳物質，但證據(jù)表明其也感知機械力。研究團隊通過活細胞核染色（5分鐘間隔）發(fā)現(xiàn)SG中的細胞核流動性顯著增強，平均速度是CG的5倍，且在16小時內移動距離更大（圖2g-i）。在翻滾過程中，細胞和細胞核的運動速度和方向呈強正相關（圖2j，k）。

圖2.細胞翻滾與MSCs中增強的數(shù)秒到數(shù)分鐘尺度的細胞骨架和核動力學有關。a. 左：通過跟蹤SG（上）和CG（下）的埋頭位移確定的15分鐘內矩陣變形的代表性熱圖。b. 左：SG（上）和CG（下）細胞中F-actin的代表性圖像。c. 三個獨立實驗中觀察到的SG（上）和CG（下）30 s內F-actin突出物的代表性變化。d. 連續(xù)兩個時間段間F-actin動態(tài)面積（獲得面積+損失面積）的計算示意圖。e.  SG中一個單元和CG中一個單元動態(tài)區(qū)域的幅度和波動的代表性示例（間隔5秒，總周期為5分鐘）。f. F-actin動力學定量作為平均動態(tài)面積（間隔5-s，總周期為5 min）。g. SG（上）和CG（下）單個細胞核的延時圖像序列。h. SG和CG細胞核的代表性運動軌跡。i. 核移動速度（5分鐘間隔，總周期16h）（左）和總移動距離（超過16h）（右）的量化。j. 細胞和細胞核運動的代表性例子（左）的速度和（右）的角度的單個細胞在細胞翻滾隨著時間的推移。k. 細胞翻滾過程中細胞與細胞核速度和角度（方向）相關性的Spearman相關值

（3）翻滾驅動MSC軟骨形成的機制

研究團隊進一步檢查了21天培養(yǎng)期間細胞翻滾的持續(xù)時間，在SG分化的第0天（包封后）、第2天和第4天進行了分鐘級活細胞成像。到第4天，SG中的MSC翻滾顯著下降至CG水平（圖3a），伴隨亞細胞動力學的減少，包括基質變形（圖3b, c）、F-actin動力學（圖3d）和核運動速度（圖3e）的降低。這表明MSC軟骨形成的前3-4天翻滾最為活躍，提示早期動力學對軟骨形成至關重要。為驗證SG增強軟骨形成是否需要關鍵的翻滾時間窗，研究團隊在不同時間用blebbistatin處理SG中的MSC以抑制翻滾，結果顯示軟骨形成顯著下降至CG水平（圖3f, g）。第3天后抑制對軟骨形成影響較小，表明前3天是增強軟骨形成的關鍵時間窗口。總體而言，早期（<4天）驅動翻滾的機制對于增強MSC軟骨形成至關重要。

圖3. 早期細胞翻滾是增強MSC軟骨形成的必要條件。a. 誘導成軟骨不同天數(shù)細胞長軸質心速度（左）和角速度（右）。b. 通過跟蹤在不同天的軟骨誘導的嵌入頭位移確定的15分鐘內基質變形的代表性熱圖。c. 量化不同軟骨誘導天數(shù)15 min內最大基質位移。d. 在誘導成軟骨的不同天數(shù)，活細胞F-actin動力學的定量（間隔5-s，總時間為5分鐘）。e. 誘導成軟骨不同天數(shù)的核速度量化。f. Blebbistatin治療方案強調在21天軟骨誘導期的不同天的治療。g. 三個獨立實驗中觀察到，在不同時間的blebbistatin阻斷SG后，21天軟骨誘導后sGAG沉積的冷凍切片樣品上具有代表性的Safranin O組織學

（4）翻滾與受抑制的染色質狀態(tài)有關

越來越多的證據(jù)表明，細胞核和染色質對外力具有高度機械敏感性。鑒于細胞核在翻滾過程中更活躍，研究團隊假設這種行為改變了核的機械感知和染色質狀態(tài)，從而調節(jié)SG的軟骨形成。為驗證此假設，該團隊通過層粘連蛋白A/C和表觀遺傳標記H3K9me3表征MSC的核機械負荷，發(fā)現(xiàn)SG中的MSCs在這兩種標記物上表現(xiàn)出更高表達和更強的核層定位（圖4a-d），表明翻滾增加了核機械負荷。為全面了解翻滾對MSC染色質可及性的影響，團隊在SG和CG包封后16小時使用ATAC-seq進行染色質可及性測定。 前10,000個基因組區(qū)域的PCA分析顯示SG和CG來自不同集群，且SG的基因組區(qū)域整體可及性下降（圖4e-g），表明翻滾與異染色質形成有關。接下來，該團隊在前3天使用催產(chǎn)素、GSK343和garcinol分別抑制H3K9me3、H3K27me3和AcK，這些處理顯著減少了第21天的軟骨形成（圖4h），證實異染色質的形成對于增強軟骨形成至關重要。此外，盡管翻滾未改變AcK的誘導，組蛋白乙酰化仍在軟骨形成中發(fā)揮重要作用，因為它可能保持了譜系特異性基因的可及性。

圖4. 細胞翻滾與被抑制的整體染色質狀態(tài)有關，這是在三維上增強MSC軟骨形成所必需的。a, b. 24小時軟骨誘導后與核機械負荷和染色質可及性相關標記物的代表性western blotting圖像(a)和定量 (b)。c. 軟骨誘導24小時后SG（上）和CG（下）不同標記物的代表性免疫熒光圖像。d. 基于不同標記物的免疫熒光成像，量化信號強度沿核邊界距離的核定位。e-g. 誘導成軟骨16小時后的ATAC-seq分析。e. 方差最大的前10000個可達染色質區(qū)域的主成分分析。f. 火山圖表示SG與CG差異分析后基因組區(qū)域的可達性模式。g. SG和CG之間差異有統(tǒng)計學意義的前50個基因組區(qū)域熱圖。h. 上圖：21天軟骨誘導期前3天不同染色質抑制劑的治療方案。下圖：三個獨立實驗中觀察到的不同染色質抑制劑誘導成軟骨21天后sGAG沉積的冷凍切片樣品上具有代表性的Safranin O組織學

（5）翻滾可以通過PLA2信號傳導調節(jié)MSC軟骨形成

鑒于細胞骨架-核耦合對細胞翻滾和增強軟骨形成至關重要，研究團隊進一步探索核機械傳感的作用。最近，核拉伸已被視為機械傳感器，可激活胞質cPLA2信號傳導并產(chǎn)生花生四烯酸（ARA），從而增強細胞骨架動力學（圖5a）。實時成像顯示SG的核在秒級時間尺度上變形增多（圖5b-d）。量化分析顯示，SG的核區(qū)波動明顯高于CG（圖5c，d），表明細胞翻滾與核拉伸增加相關。隨后，該團隊觀察到SG的核變形和cPLA2信號顯著增強，用blebbistatin抑制翻滾可降低cPLA2和p-cPLA2表達（圖5e）。接著，該團隊評估了PLA2信號對翻滾的調節(jié)，用AACOCF3抑制PLA2減少了SG中的翻滾和核運動，而外源ARA補充則增強了這一過程（圖5f，g）。盡管ARA在CG中影響較小，但適度提高了核速度。最終，該團隊在SG和CG的分化前3天用AACOCF3或ARA處理，結果顯示PLA2抑制減少了第14天的軟骨形成，而ARA促進了SG中的軟骨基質沉積（圖5h）。 上，翻滾與PLA2信號增強密切相關，可用于促進三維分化。

圖5.細胞翻滾與增強的核拉伸和PLA2信號有關，這可以調節(jié)以增強MSC軟骨形成。a. PLA2-ARA核機械感應途徑示意圖，細胞核通過該途徑感應和轉導約束并激活肌動球蛋白收縮性。b. 用H2B-eGFP標記的部分細胞核的秒尺度延時圖像序列，突出了SG（上）和CG（下）的核變形。c. 一個SG和一個CG的核面積波動超過60秒（3-s間隔）的代表性例子。d. SG和CG超過60 s的平均核面積波動。e. 誘導成軟骨24小時后PLA2信號相關標志物的代表性western blotting圖像（左）和定量圖像（右）。f. 細胞長軸質心速度（左）和角速度（右）對SG和CG中PLA2抑制和ARA補充的響應。g.  SG和CG中PLA2抑制和ARA補充對核速度的響應。h. 通過三個獨立的實驗觀察到，通過抑制PLA2和在SG中補充ARA誘導成軟骨14天后，sGAG沉積的冷凍切片樣品上具有代表性的Safranin O組織學

（6）細胞翻滾發(fā)生在三維的各種場景中

  在確認翻滾影響MSC軟骨形成后，研究團隊進一步探索其在MSC成骨和脂肪形成中的作用。組織學分析（圖6a,c）顯示，與CG相比，SG增強了MSC成骨和脂肪生成。包被后1小時起，該團隊觀察到SG中的細胞在成骨和脂肪形成過程中持續(xù)翻滾，而CG中的細胞翻滾最?。▓D6b, d）。這些結果表明，細胞翻滾與增強的多譜系分化相關。隨后，該團隊測試了翻滾在其他3D可降解和粘彈性水凝膠平臺上的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)酶降解和粘彈性水凝膠同樣支持細胞翻滾，并顯著增強了MSC軟骨形成（圖6e-h）。這些結果表明，細胞翻滾是一種在三維環(huán)境中適用于多種細胞類型的物理行為，具有廣泛的細胞生物學和組織應用潛力。

圖6.細胞翻滾與向其他譜系的三維分化增強有關，發(fā)生在各種水凝膠平臺上。a. SG（上）和CG（下）成骨誘導28天后，具有代表性的茜素紅S冷凍切片樣品的礦物沉積組織學。b.成骨誘導第0天細胞長軸質心速度（左）和角速度（右）。c. SG（上）和CG（下）誘導成脂28天后，固定全凝膠樣品的代表性油紅O染色，脂肪滴形成。d. 第0天細胞長軸質心速度（左）和角速度（右）。e. 在可降解CG（上）和CG（下）中誘導成軟骨14天后，sGAG沉積的冷凍切片樣品上具有代表性的紅花素O組織學。f. 誘導成軟骨第0天細胞長軸質心速度（左）和角速度（右）。g. 粘彈性CG（上）和CG（下）誘導成軟骨14天后sGAG沉積的冷凍切片樣品中具有代表性的紅花素O組織學。h. 誘導成軟骨第0天細胞長軸質心速度（左）和角速度（右）。i. 分鐘尺度細胞翻滾的示意圖，以及相關的時間尺度和分子機制

研究小結：

該研究團隊報告了一種以前未知的細胞行為，稱為細胞翻滾，涉及局部包含的分鐘尺度的全細胞運動，這種運動使細胞周圍ECM物理變形，并調節(jié)長期分化結果。該研究團隊的研究強調了一個事實，即翻滾增強的分化涉及多個時間尺度：(1)發(fā)生在秒到分鐘尺度上的快速細胞翻滾、細胞骨架和核動力學；(2)在誘導的最初幾天中，這些關鍵相互作用的時間和持續(xù)時間，隨后調節(jié)干細胞的長期分化。因此，對數(shù)秒到數(shù)分鐘尺度的細胞- ECM相互作用的早期控制可以關鍵地調節(jié)細胞的長期命運。雖然該研究團隊的研究主要集中在MSCs和軟骨形成上，但翻轉增強分化的生物學原理和時間尺度可能廣泛適用于在各種組織再生或疾病進展背景下增強干細胞分化和調節(jié)其他細胞命運。