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為了解決上述問(wèn)題，中國(guó)藥科大學(xué)蘇志桂教授、涂家生教授和姜雷研究員聯(lián)合團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種多功能納米平臺(tái)（_siTTENPs），用于動(dòng)脈粥樣硬化治療。該平臺(tái)由陽(yáng)離子樹(shù)狀脂肽、PLGA聚合物、靶向脂質(zhì)和治療性核酸組成，能夠靶向遞送至病變巨噬細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)特異性TRPM2基因敲低以抑制泡沫細(xì)胞形成，并通過(guò)環(huán)糊精增強(qiáng)膽固醇外流。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，該平臺(tái)顯著提高了靶向效率和膽固醇代謝調(diào)節(jié)能力，有效降低了主動(dòng)脈斑塊負(fù)荷，展現(xiàn)了良好的治療潛力。該文章于2025年6月27日以《Lesional Macrophage-Targeted Nanomedicine Regulating Cholesterol Homeostasis for the Treatment of Atherosclerosis》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202502581）。

圖1 _siTTENPs（_siTRPM2靶向及外排增強(qiáng)納米粒子）的制備工藝及在動(dòng)脈粥樣硬化治療中的應(yīng)用策略圖解。A）siTTENPs的關(guān)鍵成分。B） siTTENPs的制備工藝。C） siTTENPs治療動(dòng)脈粥樣硬化的綜合治療策略。i：靶向病變巨噬細(xì)胞。ii：抑制oxLDL的攝取和泡沫細(xì)胞的形成。iii：促進(jìn)泡沫細(xì)胞膽固醇的外排。iv：降低炎癥因子水平

（1） _siTTENPs的制備與表征

合成陽(yáng)離子樹(shù)狀脂肽G2K以增強(qiáng)siRNA穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞攝取和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放（圖S1、S2）。S2P肽通過(guò)馬來(lái)酰亞胺化學(xué)連接到DSPE-PEG2000-Mal用于靶向（圖S3），β-環(huán)糊精通過(guò)酰胺化反應(yīng)連接到DSPE-PEG2000-NHS用于增強(qiáng)膽固醇外流（圖S4）。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了納米粒配方，確定_siTTENPs的摩爾比為DSPE-PEG-S2P:DSPE-PEG-β-CD:G2K:PLGA = 18:18:26:10（圖2B、C、D）。_siTNPs、_siTTNPs、_siTENPs和_siTTENPs的粒徑分別為185 ± 5.0 nm、161 ± 6.0 nm、162 ± 5.0 nm和130 ± 4.0 nm，zeta電位接近中性，結(jié)構(gòu)呈球形且均勻（圖2E、F、G、H）。在N/P比為20時(shí)，_siTTENPs對(duì)_siTRPM2的包封效率最高（圖S5），且在含25%血清的溶液中孵育12小時(shí)后仍具有抗核酸酶降解能力，而游離siRNA在3小時(shí)內(nèi)完全降解（圖S6）。在PBS或10% FBS溶液中孵育72小時(shí)后，_siTTENPs粒徑無(wú)顯著變化，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（圖2I、J）。

圖2 _siTTENPs的制劑篩選與表征。A) _siTTENPs的關(guān)鍵組分及正交篩選。B) _siTTENPs的正交篩選矩陣。C) 使用正交篩選軟件，以四種組分設(shè)計(jì)九種制劑的摩爾比。D) 體外評(píng)估九種制劑的基因轉(zhuǎn)染效率，并以此作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用該軟件確定最佳制劑。_siTNPs、_siTTNPs、_siTENPs和_siTTENPs的表征： E )粒徑， F )多分散指數(shù) (PDI)，G) zeta電位，H) 透射電子顯微鏡 (TEM) 圖像（比例尺：100 nm）。_siTTENP 在 PBS 和 10% FBS 中的穩(wěn)定性：I) 粒度，J) PDI（n = 3，數(shù)據(jù)表示為平均值±SD；使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后進(jìn)行 Tukey 事后檢驗(yàn)）

（2）_siNTENPs的細(xì)胞攝取和內(nèi)化

研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥，模擬病變巨噬細(xì)胞環(huán)境，評(píng)估了不同納米粒的細(xì)胞攝取和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸能力。CLSM（圖3B）和流式細(xì)胞術(shù)（圖3C）結(jié)果顯示，靶向修飾的_siNTNPs和_siNTENPs細(xì)胞攝取效率顯著高于對(duì)照組（_siNNPs和_siNENPs），且在病變巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的攝取能力（圖S7）。攝取機(jī)制研究（圖S8）表明，_siNTENPs通過(guò)洞穴體和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，且依賴(lài)能量。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸實(shí)驗(yàn)（圖3D）顯示，_siNTNPs和_siNTENPs在細(xì)胞攝取3小時(shí)后與溶酶體共定位，6小時(shí)后成功逃逸至細(xì)胞質(zhì)，其中_siNTENPs的逃逸效率最高（圖S9）。此外，MTT實(shí)驗(yàn)（附錄圖S10）表明，_siTTENPs在高濃度下對(duì)病變巨噬細(xì)胞的毒性較低，細(xì)胞活性保持在80%以上。

圖3 siN TENPs的體外細(xì)胞攝取和內(nèi)化。A）實(shí)驗(yàn)流程：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞術(shù)和激光掃描共聚焦顯微鏡 (CLSM) 評(píng)估_siNTENPs 的細(xì)胞攝取。B）_siNTENPs 處理 RAW264.7 細(xì)胞 4 小時(shí)后的 CLSM 圖像。_siNTENPs 為綠色（用 FITC 標(biāo)記） ，細(xì)胞核為藍(lán)色（用 Hoechst 標(biāo)記）。_siNTENPs的濃度為 2.4 μg mL^?1 （比例尺：10 μm）。C）_siNTENPs 處理 4 和 8 小時(shí)后對(duì) RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。_siNTENPs的劑量為 2.4 μg mL^?1。 D) 分析了用_siNTENPs 處理 3 和 6小時(shí)的RAW264.7 細(xì)胞的 CLSM 圖像，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)化情況

（3）_siTTENPs調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)的體外研究

β-CD可增強(qiáng)膽固醇溶解和外流。本研究合成DSPE-PEG-β-CD構(gòu)建_siNTENPs。實(shí)驗(yàn)中，用LPS和NBD-膽固醇誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，再與不同制劑共孵育。CLSM（圖4A）顯示，含DSPE-PEG-β-CD的_siNENPs和_siNTENPs組在2小時(shí)時(shí)綠色熒光顯著降低，表明膽固醇外流增強(qiáng)；流式細(xì)胞術(shù)（圖4B）顯示_siNTENPs組4小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平降低約50%。ELISA（圖4C、D）顯示siTTENPs顯著降低TNF-α和IL-1β分泌。油紅O染色（圖4E、F）顯示_siTTENPs組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累顯著減少，吸光值最低。Western blot（圖4H、I）顯示，_siTTENPs顯著下調(diào)TRPM2和CD36蛋白表達(dá)，抑制TRPM2-CD36炎癥軸。下游蛋白pFyn和pJNK表達(dá)趨勢(shì)與TRPM2和CD36一致（圖4J、K）。結(jié)果表明，_siTTENPs通過(guò)抑制TRPM2-CD36軸減少泡沫細(xì)胞形成，并通過(guò)β-CD增強(qiáng)膽固醇外流，調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的新型策略。

圖4 _siNTENPs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。（a）CLSM圖像顯示RAW264.7細(xì)胞經(jīng)β-CD或_siNTENPs處理2小時(shí)和4小時(shí)后的膽固醇（綠色，NBD標(biāo)記）和細(xì)胞核（藍(lán)色，DAPI標(biāo)記）分布（比例尺：20 μm）；（b）流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平；（c）和（d）ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中TNF-α和IL-1β水平；（e）和（f）油紅O染色觀察_siTTENPs處理36小時(shí)后泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴（比例尺：50 μm）及定量分析；（g）小鼠主動(dòng)脈細(xì)胞中TRPM2表達(dá)的t-SNE圖；（h）Western blot檢測(cè)泡沫細(xì)胞中TRPM2/CD36軸蛋白表達(dá)；（i）Western blot檢測(cè)泡沫細(xì)胞中TRPM2和CD36蛋白表達(dá)及定量分析；（j）和（k）Western blot檢測(cè)泡沫細(xì)胞中下游蛋白pFyn和pJNK表達(dá)及定量分析（n=3，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析后接Tukey事后檢驗(yàn)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示無(wú)顯著差異）

（4）siTTENPs 治療通過(guò)靶向主動(dòng)脈血管改善ApoE^?/?小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化

ApoE^?/?小鼠高脂飲食8周后靜脈注射_siTTENPs 3周，主動(dòng)脈油紅O染色（圖5A）顯示，生理鹽水組斑塊顯著多于其他組，_siTTENPs組斑塊面積顯著減少（附錄圖S12），斑塊負(fù)荷較生理鹽水組降低3.8倍（圖5H）。血清脂質(zhì)分析顯示，_siTTENPs組TC、LDL-C和TG顯著降低，HDL-C顯著增加（圖5C、F）。ELISA檢測(cè)顯示，_siTTENPs組血清中TNF-α和IL-1β水平顯著低于生理鹽水組（圖5I、J）。這些結(jié)果表明，_siTTENPs可抑制泡沫細(xì)胞形成，促進(jìn)膽固醇外流，協(xié)同促進(jìn)斑塊消退。

進(jìn)一步研究_siNTENPs的體內(nèi)靶向能力，WT小鼠和ApoE^?/?小鼠高脂飲食后靜脈注射Cy5.5標(biāo)記的_siNTENPs。成像結(jié)果顯示，_siNTENPs在WT小鼠主動(dòng)脈中無(wú)顯著熒光，而在ApoE^?/?小鼠主動(dòng)脈中熒光顯著（圖5K）。定量分析顯示，注射后4小時(shí)，_siNTENPs組熒光強(qiáng)度約為_siNENPs組的3.5倍（圖5G），表明_siNTENPs可快速靶向并積累于主動(dòng)脈斑塊區(qū)域，12小時(shí)后部分代謝。綜上，_siTTENPs通過(guò)靶向主動(dòng)脈斑塊，實(shí)現(xiàn)斑塊消退、改善血脂和調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境，為動(dòng)脈粥樣硬化治療提供新策略。

圖5 _siTTTENPs通過(guò)靶向主動(dòng)脈血管改善ApoE^?/?小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化。（a）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)示意圖：小鼠高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型，分為5組（n=6），分別靜脈注射生理鹽水、s_iTNPs、_siTTNPs、_siTENPs和_siTTENPs（_siTRPM2劑量為3 mg/kg）；（b）油紅O染色觀察各組小鼠主動(dòng)脈整體情況及血脂分析：（c）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、（d）總膽固醇（TC）、（e）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和（f）甘油三酯（TG）；（g）小鼠主動(dòng)脈熒光強(qiáng)度定量分析；（h）小鼠斑塊面積統(tǒng)計(jì)分析（n=6）；（i）和（j）通過(guò)ELISA檢測(cè)小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平；（k）8周齡雄性野生型（WT）小鼠和ApoE^?/?（高脂飲食）小鼠靜脈注射1.6 mg/kg的Cy5.5標(biāo)記的siNENPs和siNTENPs后進(jìn)行主動(dòng)脈成像（siN：Cy5.5標(biāo)記的siNC）（n=3，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析后接Tukey事后檢驗(yàn)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示無(wú)顯著差異）

（5）_siTTENPs通過(guò)下調(diào)體內(nèi)CD 36積極促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積

為深入探究_siTTENPs減輕動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的具體機(jī)制，對(duì)主動(dòng)脈根部進(jìn)行顯微鏡觀察、免疫熒光和免疫組化分析。偏振光下觀察主動(dòng)脈根部膽固醇晶體，與生理鹽水組相比，_siTNPs、_siTTNPs和_siTENPs組膜更厚、晶體更多，而_siTTENPs組膜更薄、晶體更少（圖6A）。圖像分析顯示，_siTNPs、_siTTNPs和_siTENPs組晶體面積均有所減少，但_siTTENPs組晶體面積最小，不到5%（圖6B）。免疫熒光和免疫組化分析顯示，與生理鹽水組相比，_siTTENPs和_siTTNPs組CD36陽(yáng)性表達(dá)顯著降低，_siTTENPs組CD36陽(yáng)性表達(dá)最低，平均值為2%（圖6C）。CD68/DAPI熒光比值分析顯示，_siTTENPs和_siTTNPs組促炎巨噬細(xì)胞顯著減少，_siTTENPs組比值最低，平均為0.2（圖6D、E）；而_siTTENPs組抗炎巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206/DAPI熒光比值最高，平均值為1.0（圖6F、G）。此外，通過(guò)蘇木精-伊紅（H&E）染色和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）分析研究主動(dòng)脈根部斑塊的壞死核心和斑塊不穩(wěn)定性，_siTTENPs和_siTTNPs組壞死核心面積和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)顯著減少，_siTTENPs組最低，分別為17.8%和2%（圖6H、I、J）。綜上，_siTTENPs通過(guò)環(huán)糊精的膽固醇溶解作用和下調(diào)CD36表達(dá)，促進(jìn)膽固醇外流、減少泡沫細(xì)胞形成，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

圖6 _siTTENPs通過(guò)下調(diào)CD36減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積。（a）小鼠心臟組織切片中膽固醇晶體和CD36的免疫染色圖像（比例尺：300 μm、500 μm）；（b）膽固醇晶體的定量分析；（c）CD36⁺細(xì)胞的定量分析；（d）CD68的免疫染色圖像（比例尺：200 μm）；（e）CD68/DAPI熒光強(qiáng)度比值的定量分析；（f）CD206的免疫染色圖像（比例尺：200 μm）；（g）CD206/DAPI熒光強(qiáng)度比值的定量分析；（h）蘇木精-伊紅（H&E）染色和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的免疫染色圖像（比例尺：500 μm）；（i）壞死核心的定量分析；（j）MMP-9⁺面積的定量分析（n=3，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析后接Tukey事后檢驗(yàn)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示無(wú)顯著差異）

（6）_siTTENPs體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)及生物分布

研究評(píng)估了_siTTENPs的體內(nèi)安全性。結(jié)果顯示，治療期間小鼠體重?zé)o顯著變化（圖S13）。溶血率低于5%，表明溶血活性低（圖7A）。成像顯示_siTTENPs主要在肝臟和腎臟積累（圖7B），熒光強(qiáng)度分析表明肝臟最高，其次是腎臟（圖7C、G）。CBC檢測(cè)顯示，_siTTENPs組與對(duì)照組在血液指標(biāo)上無(wú)顯著差異（圖S14）。血清生化檢測(cè)顯示，肝功能和腎功能指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)（圖7D–J）。H&E染色顯示，_siTTENPs組的肝腎組織外觀正常，心、脾、肺組織細(xì)胞形態(tài)也正常（圖7K及圖S15）。綜上，_siTTENPs主要通過(guò)肝腎代謝，具有良好的體內(nèi)安全性和低毒性。

圖7 _siTTENPs的體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)及生物分布。（a）_siTTENPs溶血率，陽(yáng)性對(duì)照（PC）：水，陰性對(duì)照（NC）：生理鹽水；（b）Cy5.5標(biāo)記的siNCs的生物分布；（c、g）器官中Cy5.5熒光強(qiáng)度的定量分析：（c）4小時(shí)和（g）12小時(shí)；（d–f）通過(guò)（d）AST、（e）ALT和（f）ALP水平評(píng)估肝功能指標(biāo)；（h–j）通過(guò)（h）BUN、（i）UREA和（j）UA水平評(píng)估腎功能指標(biāo)；（k）肝臟和脾臟組織的蘇木精-伊紅（H&E）染色代表性圖像（比例尺：250 μm）（n=3，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析后接Tukey事后檢驗(yàn)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示無(wú)顯著差異）