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基于上述背景，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院鄭燕芳主任和暨南大學(xué)郭瑞教授團(tuán)隊(duì)合作設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種能夠共同遞送siARH 2和ART的pH/ROS響應(yīng)納米系統(tǒng)，該納米系統(tǒng)有效地激活了腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)。此外，該納米系統(tǒng)表現(xiàn)出優(yōu)異的體內(nèi)安全性、精確的PD-L1靶向以及對(duì)ROS和pH變化的響應(yīng)性。它能顯著抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞惡性表型，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。總的來說，靶向ARH 2與ART的組合代表了治療LUAD的有希望的新策略。該文章于2025年8月2日以《Inhibition of ARH2 by pH/ROS-responsive nanosystem for improved lung adenocarcinoma immunochemotherapy》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.07.042）。

圖1. 共同遞送的 siARH2 和 ART 的納米系統(tǒng)對(duì)腫瘤微環(huán)境的響應(yīng)示意圖

（1）ARH2在肺腺癌中的表達(dá)與免疫抑制的關(guān)系

使用TCGA數(shù)據(jù)庫，首先通過ESTIMATE算法計(jì)算了肺腺癌患者的免疫評(píng)分。免疫評(píng)分較高的患者存活時(shí)間明顯較長（圖2A）。相反，較低的免疫評(píng)分與較高的T分期和分期評(píng)分相關(guān)（圖2B、C）。在將免疫評(píng)分分為高和低免疫評(píng)分組后，鑒定了兩組之間的差異表達(dá)基因（DEG），并對(duì)這些DEG進(jìn)行了考克斯回歸分析。分析顯示，6個(gè)靶基因（ARH2、TERT、BCAN、S100P、FAM83F和INHA）與免疫評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，且其高表達(dá)均與低免疫評(píng)分及不良預(yù)后相關(guān)（圖2D）。這6個(gè)基因的基因集富集分析（GSEA）提示ARH2主要與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。高ARH2表達(dá)與多種免疫調(diào)節(jié)途徑的抑制相關(guān)，并與患者預(yù)后不良相關(guān)（圖2E、F）。此外，與配對(duì)的鄰近組織相比，癌組織中ARH2的表達(dá)顯著升高（圖2G）。表明ARH2在肺腺癌中發(fā)揮免疫抑制作用。

圖2.（A）基于TCGA的LUAD中免疫評(píng)分和生存期之間的相關(guān)性。（B） LUAD不同T分期間免疫評(píng)分的變化。（C）不同腫瘤分期間免疫評(píng)分的差異。（D） 6個(gè)基因與免疫評(píng)分和生存期呈負(fù)相關(guān)。（E）GSEA在高表達(dá)ARH2的LUAD中顯示了多種免疫應(yīng)答信號(hào)通路的抑制。（F） LUAD中ARH2表達(dá)和存活之間的關(guān)聯(lián)。（G）ARH2在LUAD組織中的表達(dá)顯著高于鄰近的正常組織

（2）ARH2促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化

ARH2主要定位于腫瘤周圍肺泡腔內(nèi)的M2型巨噬細(xì)胞（CD206+）。M2型巨噬細(xì)胞浸潤增多與腫瘤組織中CD8+ T細(xì)胞減少相關(guān)（圖3A）。體外CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示敲減ARH2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖無顯著影響。TCGA-GSEA證實(shí)ARH2表達(dá)與M2極化正相關(guān)（圖3B）。巨噬-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，敲減ARH2抑制M2極化并降低IL-10、Arg-1表達(dá)（圖3C、D），同時(shí)減少腫瘤細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的遷移。IL-4誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞與激活Jurkat淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，敲減ARH2提高CD69表達(dá)及IFN-γ分泌（圖3E–H），而過表達(dá)ARH2則增強(qiáng)M2極化及抗炎因子表達(dá)并抑制淋巴細(xì)胞激活和IFN-γ分泌（圖3G–I）。

圖3.（A）ARH2、CD206及CD8在肺腺癌組織中的表達(dá)定位；（B）腫瘤細(xì)胞與THP-1共培養(yǎng)示意圖；（C、D）敲減ARH2抑制A549共培養(yǎng)誘導(dǎo)的M2極化及抗炎因子表達(dá)；（E）THP-1與Jurkat共培養(yǎng)示意圖；（F、G）CD3/CD28預(yù)激活Jurkat與不同處理M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞激活標(biāo)志檢測；（H、I）同前共培養(yǎng)體系上清IFN-γ水平測定

（3）ARH2負(fù)調(diào)控FPR2促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化

TCGA高、低ARH2表達(dá)組差異基因分析顯示ALDH3A1、NQO1與ARH2正相關(guān)，而IL12RB2、FPR2與ARH2負(fù)相關(guān)（圖4A）。上述四個(gè)基因與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。QRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡（WB）驗(yàn)證顯示，ARH 2抑制顯著上調(diào)FPR 2表達(dá)，而ALDH3A1、NQO 1和IL12 RB2表達(dá)保持不變（圖4B和C）。巨噬細(xì)胞中的ARH 2過表達(dá)導(dǎo)致FPR 2表達(dá)的顯著降低。當(dāng)將FPR 2拮抗劑WRW 4引入ARH 2抑制的巨噬細(xì)胞時(shí)，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化被逆轉(zhuǎn)，并恢復(fù)IL-10與Arg1表達(dá)（圖4D和E）。ARH 2抑制還減弱PI 3 K/AKT磷酸化，過表達(dá)ARH2則增強(qiáng)該磷酸化（圖4F）。這些發(fā)現(xiàn)表明ARH 2調(diào)節(jié)FPR 2/PI 3 K/AKT通路，影響M2巨噬細(xì)胞的極化。

圖4.（A）ARH2高低表達(dá)差異前20基因熱圖；（B）THP-1敲減ARH2后FPR2 mRNA升高；（C）THP-1敲減ARH2后FPR2蛋白升高；（D、E）MH-S敲減ARH2并用WRW4阻斷FPR2后M2極化及IL-10、Arg1表達(dá)恢復(fù)；（F）THP-1敲減ARH2后AKT與PI3K磷酸化增強(qiáng)

（4）pH/活性氧雙重釋放納米系統(tǒng)的合成

首先，構(gòu)建納米殼，并通過以下方式進(jìn)行驗(yàn)證：1H NMR 與 FTIR 表征確認(rèn) mPEG 已連接醛基（圖 5A、B）；VES 與乙二胺酰胺化生成 VES-NH?（圖 5C），后者與 mPEG-CHO 縮合得到 VES-N=C-mPEG（VG）（圖 5D、E）。VP 由 VES 與 PLL 經(jīng)酰胺反應(yīng)并引入雙硒鍵合成（圖 5F、G），再與 ART 偶聯(lián)得 VPA，藥物負(fù)載量 24.67 %（圖 5H）。VPA/VG 與核酸質(zhì)量比 30:1 時(shí)，粒徑與電位恢復(fù)至復(fù)合前水平（圖 5I、J）；凝膠電泳顯示該比例下核酸遷移受限，提示 siRNA 被完全包載（圖 5K）。TEM 表明 VPA/VG 在 pH 7.4 PBS 中呈球形，弱酸中保持結(jié)構(gòu)；100 μmol/mL H?O? 引發(fā)解體，證實(shí)其氧化響應(yīng)性（圖 5L）。粒徑測定：pH 6.5 時(shí) VG 與 VPA/VG 明顯縮小，VPA 增大（圖 5M、N）；電位測定顯示 VPA 表面正電更高，VPA/VG 因 VG 包覆而降低。多溶劑穩(wěn)定性測試表明 VPA/VG 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（圖 5O）。藥物釋放實(shí)驗(yàn) 24 h 內(nèi)，ART 在弱酸＋高氧化條件下釋放最快（圖 5P）。

圖5.（A、B）FTIR與1H NMR確認(rèn)mPEG與mPEG-CHO； （C）1H NMR驗(yàn)證VES與VES-NH?；（D、E）1H NMR及FTIR顯示VES-NH?、mPEG-CHO縮合為VES-N=C-mPEG；（F、G）FTIR與1H NMR表征VES、Se-CYS、PLL生成VES-Se-Se-PLL；（H）FTIR比較ART、VP與VPA；（I、J）不同N/S比下VPA/siARH?粒徑與ζ電位；（K）VPA/siARH?凝膠阻滯分析；（L）VPA/VG復(fù)合物在不同pH/ROS環(huán)境的TEM形貌；（M、N）pH 7.4與6.5時(shí)各組粒徑及電位；（O）VPA/VG在多種溶劑中5 d粒徑穩(wěn)定性；（P）ART標(biāo)準(zhǔn)曲線與釋放曲線

（5）pH/ROS響應(yīng)納米系統(tǒng)的體外抗腫瘤作用

為了評(píng)估納米顆粒的抗腫瘤功效，CCK-8測定結(jié)果表明，在20 μg/ml的包封ART劑量下，VP和VG均未表現(xiàn)出顯著的急性毒性。流式細(xì)胞術(shù)檢測其抗腫瘤活性和活性氧的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，VPA/VG表現(xiàn)出最有效的抗腫瘤功效并產(chǎn)生相對(duì)高水平的ROS（圖6A、B）。為了研究pH依賴性效應(yīng)，CCK-8測定和FCM確定在用ART和納米系統(tǒng)處理后在各種pH條件下的細(xì)胞存活率和凋亡率。與中性條件相比，單獨(dú)的ART在酸性環(huán)境中沒有顯著增加細(xì)胞死亡。相比之下，納米系統(tǒng)表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的能力，特別是在酸性條件下（圖6C、D）。此外，壞死性凋亡抑制劑和ROS清除劑的使用有效地抑制了納米系統(tǒng)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖6E、F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，納米系統(tǒng)具有pH響應(yīng)特性，并促進(jìn)ROS生成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中的nec凋亡。

圖6.（A）不同納米體系誘導(dǎo)細(xì)胞死亡比例的流式檢測；（B）各組胞內(nèi)ROS水平的流式測定；（C、D）不同pH下納米體系與ART對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力的流式及CCK-8分析；（E、F）壞死抑制劑與ROS清除劑存在時(shí)，納米體系誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率及抑制率的流式與CCK-8評(píng)估

（6）PD-L1靶向納米系統(tǒng)增強(qiáng)腫瘤靶向

為了評(píng)估納米系統(tǒng)的siRNA轉(zhuǎn)染效率，使用FCM測量Cy 5標(biāo)記的siRNA的熒光強(qiáng)度（圖7A）。WB和qRT-PCR分析證實(shí)納米系統(tǒng)有效地下調(diào)ARH 2表達(dá)。此外，當(dāng)納米系統(tǒng)與PD-L1靶向肽偶聯(lián)時(shí)，其在調(diào)節(jié)ARH 2表達(dá)方面表現(xiàn)出增強(qiáng)的功效（圖7 B、C）。抑制MH-S細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)納米顆粒系統(tǒng)的攝取減少（圖7D、E）。此外，納米系統(tǒng)與PD-L1靶向肽的綴合也增加了它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。然而，當(dāng)納米系統(tǒng)負(fù)載siARH 2時(shí)，它們的腫瘤抑制作用保持不變（圖7F、G）。這些結(jié)果表明，PD-L1靶向肽的摻入使納米系統(tǒng)能夠特異性靶向并將siARH 2遞送到腫瘤細(xì)胞中，從而增強(qiáng)其治療潛力。

圖7.（A）Cy5-siARH2復(fù)合物處理48 h后LLC與MH-S細(xì)胞的流式攝取結(jié)果；（B、C）不同復(fù)合物處理下MH-S細(xì)胞ARH2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量；（D）WB檢測MH-S細(xì)胞PD-L1表達(dá)；（E）FCM分析PD-L1沉默細(xì)胞的納米藥物攝??；（F、G）細(xì)胞凋亡與CCK-8評(píng)估各組A549細(xì)胞殺傷能力

（7）納米系統(tǒng)抑制腫瘤生長并增強(qiáng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)

圖8A示尾靜脈注射后，VPA/VG組小鼠生存期最長（圖8B）；FCM與IHC顯示其腫瘤內(nèi)M2巨噬細(xì)胞（CD206?/Arg1?）顯著減少、M1巨噬細(xì)胞（iNOS?）顯著增加（圖8C、D）。VP/VG包載siARH2未延長生存期，而共載ART與siARH2后生存期超過VPA/VG組（圖8E），且腫瘤內(nèi)M2巨噬細(xì)胞進(jìn)一步降低、M1巨噬細(xì)胞升高（圖8F、G）。

圖8.（A）LLC荷瘤小鼠模型建立及給藥方案；（B）各組小鼠生存曲線；（C、D）FCM與IHC檢測不同處理腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞面積；（E）各組小鼠生存曲線；（F、G）FCM與IHC再次量化腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞面積

（8）與PD-L1靶向肽綴合的合成納米系統(tǒng)提高了腫瘤靶向和抗腫瘤功效

為了研究納米系統(tǒng)的生物分布，將Cy 5標(biāo)記的siARH 2摻入到系統(tǒng)中，并進(jìn)行體內(nèi)成像。結(jié)果表明，Cy5-siARH2標(biāo)記納米體系靜脈注射24 h后，腫瘤熒光信號(hào)顯著且PD-L1靶向肽進(jìn)一步增強(qiáng)定位（圖9A）；12、24、36 h動(dòng)態(tài)成像顯示腫瘤蓄積遞增，肝腎信號(hào)遞減（圖9B）。PD-L1肽修飾體系顯著抑制皮下瘤生長并降低瘤內(nèi)M2巨噬細(xì)胞（圖9C–E），同時(shí)減少肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及M2浸潤（圖9F、G）；脾臟FCM示CD8? T細(xì)胞比例顯著升高（圖9H）。

圖9.（A）靜脈注射合成的納米系統(tǒng)24小時(shí)后，腫瘤小鼠器官的體內(nèi)熒光成像。（B）采用組織成像技術(shù)檢測不同時(shí)間點(diǎn)VPA-siARH 2-PDL 1 pep/VG在不同組織中的蓄積。（C）不同處理的LLC荷瘤小鼠中分離的腫瘤。（D）荷瘤小鼠經(jīng)不同處理后的腫瘤生長曲線。（E）IHC用于評(píng)估不同處理組腫瘤中M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量（左）。浸潤的Arg 1陽性巨噬細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量（右）。（F）肺組織切片的HE染色顯示（左）。肺轉(zhuǎn)移性腫瘤的定量（右）（G）小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤中M2型巨噬細(xì)胞含量的IHC分析（左）。浸潤的Arg 1陽性巨噬細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量（右）。（H）CD 3 + CD 8 + T細(xì)胞的代表性FCM結(jié)果（左）和定量分析（右）

（9）納米系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)FPR 2/AKT信號(hào)通路增強(qiáng)免疫反應(yīng)

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)PD-L1靶向肽偶聯(lián)納米系統(tǒng)處理的MH-S巨噬細(xì)胞中，F(xiàn)PR2表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)PI3K/AKT磷酸化水平明顯下調(diào)（圖10A）。荷瘤小鼠腫瘤組織的IHC染色進(jìn)一步驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)，顯示FPR2豐度升高且p-AKT降低，其中PD-L1靶向肽修飾組效果最為顯著（圖10B）。多重免疫熒光（MIF）定量分析揭示，該納米系統(tǒng)重塑腫瘤免疫微環(huán)境：與對(duì)照相比，治療組腫瘤內(nèi)CD206⁺ M2型巨噬細(xì)胞浸潤減少，CD86 ⁺ M1型巨噬細(xì)胞浸潤增加，并伴隨CD8⁺ T細(xì)胞顯著募集（圖10C）。結(jié)果說明該納米系統(tǒng)可通過FPR2/AKT信號(hào)軸有效激活抗腫瘤免疫應(yīng)答。

圖10（A）WB法檢測不同藥物處理后MH-S細(xì)胞中FPR2、AKT、PI3K、p-AKT和p-PI3K的表達(dá)。（B）IHC檢測用不同藥物處理小鼠腫瘤中FPR2、AKT和p-AKT的表達(dá)。（C）進(jìn)行多重免疫熒光以定量小鼠腫瘤組織中CD8⁺、CD86+或CD206⁺細(xì)胞群的變化