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針對上述問題，武漢大學(xué)黃翠和張先正研究團(tuán)隊提出基于紅細(xì)胞仿生的納米囊泡（GLR）用于牙周炎治療的新策略。研究發(fā)現(xiàn)，P. gingivalis通過與紅細(xì)胞聚集和裂解來獲取鐵和血紅素，這對細(xì)菌的生長和毒力至關(guān)重要。該團(tuán)隊開發(fā)的GLR能夠精準(zhǔn)靶向并黏附于P. gingivalis，利用其對鐵的需求，將具有抗菌活性的鎵卟啉遞送至細(xì)菌內(nèi)部，破壞細(xì)菌代謝過程。GLR在藍(lán)光照射下可產(chǎn)生大量活性氧（ROS），與鎵離子的代謝干擾協(xié)同作用，顯著增強(qiáng)對P. gingivalis的殺傷效果。體外實驗表明，GLR能有效抑制P. gingivalis生長，減少其對上皮細(xì)胞的侵襲，減輕炎癥反應(yīng)。在牙周炎大鼠模型中，GLR聯(lián)合光療顯著減少了P. gingivalis在齦下菌斑中的比例，抑制了牙槽骨吸收，降低了牙齦出血指數(shù)，減少了炎癥因子表達(dá)。該策略為牙周炎精準(zhǔn)治療提供了新思路。該文章于2024年7月19日以《Erythrocyte-Mimicking Nanovesicle Targeting Porphyromonas gingivalis for Periodontitis》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c02316）。

圖1 P. gingivalis與GLR的相互作用示意圖。（a）P. gingivalis與GLR聚集并將其裂解以獲取鎵卟啉，隨后因代謝紊亂和光動力治療而死亡；（b）GLR通過擾亂細(xì)菌代謝和光動力作用抑制P. gingivalis；（c）牙周袋中的P. gingivalis被GLR包裹，削弱了它們對上皮細(xì)胞的侵襲

（1）紅細(xì)胞與P. gingivalis之間的相互作用

P. gingivalis可通過血凝素粘附到紅細(xì)胞上，破壞紅細(xì)胞膜并利用儲存血紅素。實驗中，P. gingivalis與變形鏈球菌和大腸桿菌Nissle 1917對紅細(xì)胞的粘附能力對比顯示，P. gingivalis對紅細(xì)胞粘附性更強(qiáng)（圖2A），其（藍(lán)色）多粘附于紅細(xì)胞（紅色）表面并聚集成簇。Transwell實驗表明，P. gingivalis更易遷移到含血紅素和紅細(xì)胞的培養(yǎng)基中（圖2B、C）。這些結(jié)果證實了P. gingivalis與紅細(xì)胞的相互作用，為構(gòu)建靶向P. gingivalis的紅細(xì)胞仿生納米囊泡提供了依據(jù)。

圖2 P. gingivalis與紅細(xì)胞相互作用及相關(guān)材料表征。（a）P. gingivalis與紅細(xì)胞粘附的SEM圖像；（b）Transwell實驗圖像；（c）數(shù)據(jù)分析；（d）P. gingivalis與紅細(xì)胞聚集并利用鐵卟啉的示意圖；（e）鐵卟啉（左）和鎵卟啉（右）的化學(xué)結(jié)構(gòu)；（f）負(fù)載鎵卟啉的紅細(xì)胞膜脂質(zhì)體（GLR）的示意圖；（g）GLR合成過程中的zeta電位變化；（h）RBC、LP、LR、GLP和GLR的SDS-PAGE分析；（i）LP、LR、GLP和GLR的粒徑；（j）GLR的TEM圖像和（k）SEM圖像；（l）LP、LR、GLP和GLR的UV-vis吸收光譜；（m）在藍(lán)光下LP、LR、GLP和GLR的熒光光譜；（n）通過DCFH檢測鎵卟啉（G）、LP、LR、GLP和GLR在藍(lán)光下產(chǎn)生的ROS

（2）GLR 與 P. gingivalis 的粘附情況

電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP）分析顯示，GLR組中粘附或被P.gingivalis吸收的鎵離子數(shù)量約為GLP組的兩倍（圖3A）。P.gingivalis與GLR混合后粒徑增大（圖3B）。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，GLR與P.gingivalis粘附性強(qiáng)，能包裹P.gingivalis，而GLP與P.gingivalis粘附性弱（圖3C）。高角環(huán)形暗場掃描透射電子顯微鏡（HAADF-STEM）圖像顯示，經(jīng)GLR處理的P.gingivalis內(nèi)有少量鎵離子聚集（圖3D）。約23.2%的P.gingivalis細(xì)胞與GLR粘附，與GLP粘附的P.gingivalis細(xì)胞僅約1.41%（圖3E）。在更生理環(huán)境下，將人類齦下菌斑與P.gingivalis共培養(yǎng)形成生物膜并用GLR處理，倒置顯微鏡結(jié)果顯示，GLR（用DIL標(biāo)記為紅色）仍能很好地聚集到P.gingivalis上，混合細(xì)菌生物膜用Hoechst 33342標(biāo)記為藍(lán)色（圖3F），表明GLR在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中靶向齦下菌斑中的P.gingivalis具有可行性。

（3）GLR 在刺激下產(chǎn)生活性氧（ROS）

GLP和GLR產(chǎn)生細(xì)胞外ROS能力無顯著差異（圖3G），提示鎵卟啉在藍(lán)光下產(chǎn)生活性氧的能力與其是否粘附在細(xì)菌表面或游離于溶液中無關(guān)。經(jīng)GLR處理的P.gingivalis中氧化應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞比例約11.9%，顯著高于其他對照組（<5%）（圖3H），其平均熒光強(qiáng)度（MFI）也顯著高于其他組（圖3I），可能因GLR粘附于P.gingivalis細(xì)胞表面甚至部分進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，在藍(lán)光照射下，除卟啉自身產(chǎn)生ROS外，細(xì)菌自身應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的ROS幾乎可忽略不計。

（4）GLR 與 P. gingivalis 的降解實驗

P.gingivalis可通過血凝素（如HagA）、gingipain的粘附域（Kgp和HRgpA）及其他蛋白（如HBP35）與紅細(xì)胞結(jié)合，其釋放的溶血素和其他蛋白酶會破壞紅細(xì)胞膜，導(dǎo)致血紅蛋白釋放。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，GLR在P.gingivalis上清液中發(fā)生降解（圖3J），表明GLR成功模仿紅細(xì)胞，且P.gingivalis可進(jìn)一步降解GLR以利用其中的鎵卟啉。在P.gingivalis存在時，GLR中鎵卟啉的釋放量顯著低于其不存在時（圖3K），可能是由于GLR的降解以及P.gingivalis對鎵卟啉的利用，導(dǎo)致鎵卟啉釋放量減少。

圖3 P.gingivalis與GLP、GLR相互作用的表征。（a）通過ICP分析P.gingivalis與GLP或GLR共孵育后Ga3?離子濃度；（b）P.gingivalis與GLP或GLR聚集后的粒徑變化；（c）P.gingivalis與GLP或GLR共孵育30分鐘后的TEM圖像；（d）P.gingivalis與GLR共孵育后的HAADF-STEM圖像及C、O和Ga元素分布；（e）流式分析顯示用SYTO 9標(biāo)記的P.gingivalis與用DIL標(biāo)記的GLP或GLR的粘附情況；（f）用DIL標(biāo)記的GLR與含Hoechst 33342標(biāo)記的人類齦下菌斑和SYTO 9標(biāo)記的P.gingivalis共建的生物膜的熒光圖像；（g）用DCFH檢測P.gingivalis在與PBS、LP、LR、GLP和GLR共孵育并在藍(lán)光下處理后的細(xì)胞外ROS產(chǎn)生；（h）流式分析和（i）熒光強(qiáng)度顯示P.gingivalis在用PBS、LP、LR、GLP或GLR處理并在藍(lán)光下處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生；（j）GLR在P.gingivalis上清液中處理后的降解TEM圖像；（k）GLR在含或不含P.gingivalis的PBS中的鎵卟啉釋放情況

（5）GLR 對 P. gingivalis 的抑制作用

在無光條件下，GLP和GLR對P.gingivalis的抗菌效果分別為18%和40%（圖4A）；有光條件下，GLP和GLR的抑制率分別增加30%和80%（圖4B），表明GLR比GLP更易被P.gingivalis識別利用，可能因GLR表面暴露的紅細(xì)胞膜相關(guān)蛋白，且鎵離子利用影響細(xì)菌代謝，卟啉沉積在光照下引發(fā)ROS產(chǎn)生致細(xì)菌死亡。向經(jīng)不同材料預(yù)處理的P.gingivalis中加入5 mM H?O?，GLP和GLR的抑制率分別為22%和50%（圖4C），未處理的P.gingivalis能耐受該濃度H?O?，單獨GLP或GLR抑制率僅18%和40%（圖4A），說明GLR處理顯著降低P.gingivalis對氧化應(yīng)激的抵抗力。與單獨H?O?（8.5%）或GLR（35.6%）相比，GLR與H?O?聯(lián)用抑制效果增強(qiáng)（49.4%）；與單獨光照射（Hv，14.8%）或GLR（35.6%）相比，GLR與光照射聯(lián)用抑制效果顯著增強(qiáng)（79.4%）（圖4D、4E），證實鎵離子引起的代謝紊亂和卟啉產(chǎn)生的ROS協(xié)同有效殺死P.gingivalis。計數(shù)（圖4F）和SEM觀察處理后細(xì)菌（圖4G）顯示，GLR與光照射聯(lián)用能破壞P.gingivalis結(jié)構(gòu)并有效抑制其生長。

圖4 P.gingivalis的抗菌效果及生物膜處理結(jié)果。（a）PBS、LP、LR、GLP或GLR對P.gingivalis的抗菌效果；（b）在藍(lán)光下PBS、LP、LR、GLP或GLR對P.gingivalis的抗菌效果；（c）在H?O?處理下PBS、LP、LR、GLP或GLR對P.gingivalis的抗菌效果；（d）抗菌效果比較和（e）流式分析顯示不同條件下GLR對P.gingivalis的抗菌效果；（f）P.gingivalis在不同條件下的數(shù)量；（g）SEM圖像；（h）人齦下菌斑建立的生物膜在用PBS、LP、LR、GLP或GLR處理并在藍(lán)光下照射后的殘留面積；（i）相對定量

（6）GLR 對 P. gingivalis 代謝的擾亂作用

RNA轉(zhuǎn)錄組分析顯示，吸收鎵卟啉的P.gingivalis基因表達(dá)顯著變化，有832個基因表達(dá)上調(diào)，815個基因表達(dá)下調(diào)（圖5A）。差異表達(dá)基因的基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析表明，GLR處理后，P.gingivalis的碳水化合物代謝、輔因子和維生素代謝、能量代謝以及大分子生物合成過程等生物過程受到影響（圖5B、5C），證實GLR通過擾亂代謝抑制P.gingivalis生長。

（7）GLR 減少 P. gingivalis 對上皮細(xì)胞的侵襲

圖5D顯示不同材料處理后P.gingivalis對上皮細(xì)胞的粘附或侵襲及氧化應(yīng)激反應(yīng)。GLR處理組P.gingivalis對上皮細(xì)胞粘附顯著減少，其他組仍有粘附或侵襲能力。流式細(xì)胞術(shù)定量細(xì)胞內(nèi)ROS（圖5E、5F）顯示，GLR處理組上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激顯著降低，LR和GLR處理組有一定效果，LR處理組氧化應(yīng)激水平降低可能因LR與P.gingivalis競爭性結(jié)合減少其與上皮細(xì)胞接觸，GLP處理組中GLP釋放的鎵卟啉部分抑制P.gingivalis活性。P.gingivalis對上皮細(xì)胞的侵襲情況如圖5G所示，PBS組和LP處理組觀察到大量細(xì)菌侵襲，LR和GLP處理組僅少量細(xì)菌侵襲，而GLR處理組上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌侵襲極少，表明GLR策略可與P.gingivalis結(jié)合抑制其活性，阻止其與上皮細(xì)胞接觸和侵襲。

圖5 P.gingivalis經(jīng)GLR處理后的轉(zhuǎn)錄組分析及對上皮細(xì)胞的影響。（a）RNA測序分析顯示P.gingivalis經(jīng)GLR處理后表達(dá)差異顯著的基因數(shù)量的散點圖；（b）KEGG注釋分析；（c）GO富集分析顯示P.gingivalis經(jīng)GLR處理后的結(jié)果；（d）共聚焦顯微鏡圖像顯示不同處理后P.gingivalis對上皮細(xì)胞的粘附情況；（e）流式細(xì)胞術(shù)和（f）定量分析顯示不同處理后上皮細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況；（g）電子顯微鏡圖像顯示P.gingivalis對上皮細(xì)胞的侵襲情況

（8）GLR 抑制大鼠牙周炎的進(jìn)展

采用∞-結(jié)扎法建立大鼠牙周炎模型并接種P.gingivalis（圖6A），用PBS、Hv或GLR聯(lián)合Hv（GLR/Hv）治療。三維微CT重建（圖6B）和統(tǒng)計分析（圖6C）顯示GLR/Hv治療有效抑制牙槽骨吸收。牙齦出血指數(shù)（GBI）評分（圖6D）和炎癥因子（IL-6和TNF-α）表達(dá)（圖6E）均表明GLR/Hv治療減輕牙齦組織炎癥，可能因GLR與P.gingivalis競爭性結(jié)合減少其侵襲。熒光原位雜交（FISH）切片實驗（圖6F）顯示GLR組中P.gingivalis侵入牙齦組織數(shù)量最少。治療后大鼠重要器官切片未見明顯異常（圖S26），血常規(guī)檢查顯示PBS組白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多（圖6G），而GLR/Hv治療組血液指標(biāo)與健康大鼠無顯著差異。電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP）分析顯示GLR/Hv組大鼠肝臟和腎臟未檢測到鎵離子顯著積累（圖6H），表明GLR策略具體內(nèi)應(yīng)用潛力。

（9）GLR 在體內(nèi)抑制齦下菌斑中的 P. gingivalis

Hv處理降低了齦下菌斑中P.gingivalis的豐度，可能與P.gingivalis所含鐵卟啉對藍(lán)光敏感有關(guān)。GLR與Hv聯(lián)合使用幾乎完全清除了齦下菌斑中的P.gingivalis（圖6I、6J），表明GLR能靶向P.gingivalis并降低其在牙周炎中的數(shù)量。

圖6 大鼠牙周炎模型的建立及治療效果評估。（a）通過∞-結(jié)扎法建立大鼠牙周炎模型并在結(jié)扎區(qū)域接種P.gingivalis；（b）大鼠上頜結(jié)扎區(qū)經(jīng)治療后的微CT掃描3D重建；（c）經(jīng)治療后牙周骨吸收距離的測量（從牙槽嵴到牙釉質(zhì)牙骨質(zhì)界）；（d）經(jīng)治療后的牙齦出血指數(shù)（GBI）評分；（e）經(jīng)治療后牙齦組織中IL-6（綠色）和TNF-α（紅色）的表達(dá)；（f）用FISH可視化顯示P.gingivalis（紅色）在牙齦組織中的位置；（g）大鼠經(jīng)治療后的血常規(guī)檢查；（h）通過ICP分析大鼠肝臟或腎臟中殘留的鎵離子；（i）經(jīng)治療后齦下微生物群落中前20個細(xì)菌比例的熱圖；（j）經(jīng)治療后齦下微生物群落中P.gingivalis比例的變化情況