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為了解決上述問(wèn)題，韓國(guó)光州科學(xué)技術(shù)院 Dongryeol Ryu團(tuán)隊(duì)以膠原為基、絲素蛋白為增強(qiáng)相，先將人脂肪干細(xì)胞（hASCs）混入制成復(fù)合生物墨水；再通過(guò)“離心-發(fā)泡”制得均一多孔凝膠后，引入“單軸拉伸”工藝，使孔道與膠原纖維同步定向，形成仿生骨骼肌的各向異性微結(jié)構(gòu)。該法無(wú)需電場(chǎng)或雙重光交聯(lián)，簡(jiǎn)便可控。結(jié)果表明，所得膠原/絲素-多孔-hASC構(gòu)建體在力學(xué)強(qiáng)度、細(xì)胞存活、肌向分化及體內(nèi)體積性肌肉缺損（VML）修復(fù)方面均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)無(wú)序多孔或單純膠原體系，證明其可作為肌肉及其他各向異性組織再生的通用平臺(tái)。該文章于2025年7月10日以《Cell-Laden Constructs with Anisotropic Pores Fabricated by Collagen/Silk-Fibroin for Muscle Tissue Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202503933）。

（1）不同膠原基泡沫和復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)和生物效應(yīng)圖解

圖1a、b顯示了高孔隙度膠原蛋白細(xì)胞負(fù)載支架的結(jié)構(gòu)特征及其優(yōu)缺點(diǎn)。該結(jié)構(gòu)具有良好的生物相容性和細(xì)胞黏附增殖能力，但純膠原支架機(jī)械強(qiáng)度低，限制其在負(fù)重組織構(gòu)建中的應(yīng)用。圖1c展示了通過(guò)引入S–F形成分子間互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)（IPN）以增強(qiáng)膠原支架力學(xué)性能的策略。該復(fù)合結(jié)構(gòu)在保持孔隙度和生物相容性的同時(shí)顯著提高了機(jī)械性能，適用于軟骨、肌腱等對(duì)力學(xué)性能要求較高的組織工程（圖1c）。圖1d展示了通過(guò)3D打印過(guò)程引入拉伸步驟構(gòu)建具有各向異性孔結(jié)構(gòu)的膠原/S–F支架。該結(jié)構(gòu)模擬天然組織中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的有序排列，支持細(xì)胞定向排列及組織導(dǎo)向形成（圖1d）。進(jìn)一步地，圖1d還顯示了構(gòu)建體中整合hASCs后的應(yīng)用效果。各向異性孔結(jié)構(gòu)結(jié)合IPN增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)為細(xì)胞排列及分化提供良好微環(huán)境，展現(xiàn)出在肌腱、韌帶和心肌等具有方向性力學(xué)需求組織再生中的應(yīng)用潛力（圖1d）。

圖1 不同膠原基泡沫和復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)和生物效應(yīng)圖解。a) 攪打前的膠原水凝膠，顯示均勻的凝膠基質(zhì)。b) 以 2500 rpm 的轉(zhuǎn)速攪打后的膠原泡沫，其中空氣被注入基質(zhì)，導(dǎo)致形成多孔結(jié)構(gòu)和膠原聚集。c) 膠原蛋白/絲素蛋白 (S-F) 復(fù)合泡沫，顯示膠原蛋白和 SF 之間形成互穿網(wǎng)絡(luò) (IPN)，從而形成增強(qiáng)的、更穩(wěn)定的多孔結(jié)構(gòu)。d) 使用收集器 (寬度 = 6 mm) 以 75 rpm 的轉(zhuǎn)速形成的拉伸多孔復(fù)合泡沫，展示了孔隙的排列以及更明確和結(jié)構(gòu)化的泡沫形態(tài)的發(fā)展

（2）選擇合適的膠原蛋白和S-F混合比例以獲得穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)

膠原蛋白因其豐富的細(xì)胞黏附位點(diǎn)常用于組織再生研究；S–F則具有優(yōu)異的力學(xué)性能，常用于負(fù)重組織修復(fù)（圖2a）。兩者在膠凝過(guò)程中分別通過(guò)膠原纖維化和S–F的β-折疊形成互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)（IPN），顯著增強(qiáng)復(fù)合材料的力學(xué)性能。圖2b顯示膠原蛋白具有接近1:1的兩性特性，而S–F則以疏水性為主（約8:2），圖2c示意通過(guò)打發(fā)過(guò)程誘導(dǎo)泡沫結(jié)構(gòu)形成。圖2d提出較高膠原含量有利于穩(wěn)定泡沫的構(gòu)建，而高S–F比例則削弱泡沫穩(wěn)定性。

將5 wt.%膠原和5 wt.% S–F按不同比例混合（CS10、CS73、CS55、CS37、CS01），稀釋至總濃度約2.8%。光學(xué)顯微鏡與SEM圖像顯示所有組別均形成泡沫結(jié)構(gòu)，但純S–F組無(wú)膠原纖維形成（圖2e）。隨著S–F比例增加，孔徑增大（圖2f）、泡沫體積分?jǐn)?shù)下降（圖2g）、Laplace壓降低（圖2h），說(shuō)明泡沫穩(wěn)定性變差。CS73組泡沫生成速度較快（圖S2a,b），孔體積分?jǐn)?shù)與孔徑與CS10無(wú)顯著差異，提示其具備良好結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

FT-IR分析（圖2i）顯示S–F經(jīng)打發(fā)后酰胺I帶位移（1650→1627 cm^-1），說(shuō)明發(fā)生β-折疊結(jié)構(gòu)形成；酰胺II帶位移（1523→1546 cm^-1）提示S–F與膠原相互作用引起二級(jí)結(jié)構(gòu)改變。CD譜圖（圖S3）顯示，CS10在222 nm處具有典型三螺旋峰，添加S–F后該峰減弱，表明膠原結(jié)構(gòu)受其影響，促進(jìn)纖維形成。

綜上，S–F疏水性過(guò)強(qiáng)會(huì)干擾氣液界面形成及IPN網(wǎng)絡(luò)建立，但在膠原與S–F比例為7:3時(shí)，可快速形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、泡沫性能良好的復(fù)合支架，兼具高孔隙度與優(yōu)良力學(xué)性能，適用于對(duì)力學(xué)強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性要求較高的組織工程應(yīng)用。

圖2 膠原蛋白和S-F之間的互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)（IPN）、它們的分子結(jié)構(gòu)、泡沫形成的攪打過(guò)程以及泡沫性能的表征。a）纖維化膠原蛋白和β折疊形成的S-F之間的IPN示意圖。b）膠原蛋白和S-F的分子結(jié)構(gòu)和兩親性。c）攪打過(guò)程示意圖和d）膠原蛋白（左）和S-F為主（右）泡沫中隨之形成的氣液界面示意圖。e）光學(xué)和掃描電子顯微鏡（SEM）圖像，f）孔徑（n=30），g）注入空氣的最大分?jǐn)?shù)（n=3），以及h）計(jì)算得出的具有不同膠原蛋白/S-F混合比（CS10、CS73、CS55、CS37和CS01）（n=3）的泡沫的拉普拉斯壓力。i）攪打前泡沫和純S-F的FT-IR分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示（NS = 統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和*** p < 0.001，使用帶有ANOVA和Tukey的HSD事后檢驗(yàn)的SPSS軟件進(jìn)行分析）

（3）攪打復(fù)合生物墨水的流變性和印刷適性

圖3a顯示未打發(fā)與打發(fā)后的不同膠原/S–F比例生物墨水在水平與傾斜表面上的形貌。未打發(fā)前，S–F含量越高，液滴流動(dòng)性越強(qiáng)（圖S4a,b），表明粘度下降；打發(fā)后各組差異明顯減小。圖3b展示IPN結(jié)構(gòu)形成提高生物墨水粘度與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的機(jī)理。在打印性能測(cè)試中，CS10在25G噴嘴下擠出后無(wú)法保持條帶形狀，表現(xiàn)為液滴態(tài)（圖3c）；CS73表現(xiàn)出較好的條帶連續(xù)性與均一性；CS55次之；CS37擠出困難并堆積于噴嘴口。纖維塌陷測(cè)試結(jié)果（圖3d和圖S6）進(jìn)一步證實(shí)，CS10條帶在支柱間間距大于3 mm時(shí)發(fā)生斷裂；CS73在6 mm間距下仍可保持完整結(jié)構(gòu)；CS55結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；CS37無(wú)有效連接。剪切速率掃描（圖3e，圖S7）及剪切變稀系數(shù)n（圖3f）顯示，CS73具有最高粘度與最強(qiáng)剪切變稀特性。剪切應(yīng)力掃描分析（圖S8）顯示，CS10、CS73、CS55的屈服應(yīng)力（τy）差異不顯著，但其流動(dòng)點(diǎn)（τf）分別為約12、113、122 Pa，CS37無(wú)明顯流動(dòng)點(diǎn)（圖3g,h），表明其結(jié)構(gòu)過(guò)于固態(tài)化。粘度恢復(fù)測(cè)試（150%、200%、300%應(yīng)變）顯示各組恢復(fù)率均超過(guò)90%，差異不顯著，具良好形變恢復(fù)能力（圖3i,j）。綜上，CS10擠出性佳，但因粘度與結(jié)構(gòu)恢復(fù)能力不足，成型穩(wěn)定性差；CS73兼具高粘度、強(qiáng)剪切變稀性與適中流動(dòng)點(diǎn)，可在擠出過(guò)程中保證順暢性與結(jié)構(gòu)完整性，為打印性能最優(yōu)組合。該體系的力學(xué)性能與成型穩(wěn)定性優(yōu)于純膠原墨水（CS10），為后續(xù)3D負(fù)載細(xì)胞結(jié)構(gòu)構(gòu)建提供基礎(chǔ)，并具潛力促進(jìn)細(xì)胞機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)，有利于組織再生。后續(xù)研究圍繞CS73展開打印構(gòu)建物的力學(xué)與細(xì)胞功能評(píng)估。

圖3 攪打、擠出性測(cè)試、支柱塌陷和流變學(xué)分析過(guò)程中膠原蛋白泡沫行為的可視化。a) 攪打前后膠原基材料滴的光學(xué)圖像，以 0 和 90° 傾斜 10 分鐘。b) 攪打過(guò)程中分子間網(wǎng)絡(luò)形成的示意圖。c) 無(wú)噴嘴和有 18G 和 25G 噴嘴的擠出性測(cè)試（n = 10）和 d) 使用含膠原蛋白泡沫的 25G 噴嘴的支柱塌陷測(cè)試。e 和 f) 剪切速率掃描（n = 3）、g 和 h) 剪切應(yīng)力掃描（n = 3）以及 i 和 j) 時(shí)間掃描（n = 3）的定量流變學(xué)分析分別用于評(píng)估泡沫的剪切稀化、流動(dòng)起始和粘度恢復(fù)行為。所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示（NS = 統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和*** p < 0.001，使用帶有ANOVA和Tukey的HSD事后檢驗(yàn)的SPSS軟件進(jìn)行分析）

（4）攪打膠原蛋白 (CS10) 和復(fù)合生物墨水 (CS73) 的體外細(xì)胞活性

圖4a展示了采用CS10和CS73生物墨水（含hASCs，1×10? cells/mL）構(gòu)建的3D多孔細(xì)胞結(jié)構(gòu)，經(jīng)1 mM龍膽紫交聯(lián)1小時(shí)處理。圖S9顯示交聯(lián)顯著增強(qiáng)了含S–F樣品的流變性能和壓縮力學(xué)性能。圖4b為交聯(lián)后構(gòu)建物的光學(xué)圖像。蛋白吸附實(shí)驗(yàn)表明CS10和CS73對(duì)蛋白具有較強(qiáng)吸附能力（圖S10），12小時(shí)內(nèi)細(xì)胞活性明顯提升，且兩者差異不顯著。

圖4c為構(gòu)建物的應(yīng)力–應(yīng)變曲線，結(jié)果顯示CS73因IPN結(jié)構(gòu)的形成，其楊氏模量顯著高于CS10，力學(xué)性能增強(qiáng)。圖4d通過(guò)活/死染色顯示兩組細(xì)胞存活率接近，表明生物相容性良好。圖4e免疫熒光染色（DAPI、PIEZO-1、vinculin）顯示，CS73在細(xì)胞黏附與力學(xué)感應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)上高于CS10，提示其對(duì)細(xì)胞機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)具有正向調(diào)控作用（圖4f），并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成與成熟（圖4g）。RT-PCR結(jié)果顯示，CS73中大多數(shù)與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因表達(dá)水平高于CS10（圖4h），表明其增強(qiáng)的力學(xué)性能可激活相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路，促進(jìn)組織再生相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。

圖4 3D 細(xì)胞負(fù)載復(fù)合泡沫的制造和交聯(lián)、機(jī)械測(cè)試、細(xì)胞活力和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)分析。a) 使用京尼平制造 3D 細(xì)胞負(fù)載復(fù)合泡沫結(jié)構(gòu)和交聯(lián)過(guò)程的示意圖。b) CS10 和 CS73 3D 構(gòu)造 (n = 3) 的光學(xué)圖像和 c) 拉伸機(jī)械結(jié)果（應(yīng)力-應(yīng)變曲線和楊氏模量）。d) 活/死測(cè)定圖像和 e) DAPI/PIEZO-1/紐結(jié)蛋白的免疫熒光圖像。f) 第 1 天的初始細(xì)胞活力定量分析，以及第 1 天和第 3 天的 PIEZO-1+ 和紐結(jié)蛋白+ 區(qū)域的定量分析（n = 3）。g) 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)下游信號(hào)通路的示意圖。h) 第 3 天的相對(duì)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)（n = 4）。所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示（NS = 統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和*** p < 0.001，使用 SPSS 軟件通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行分析）

（5）各向異性孔結(jié)構(gòu)復(fù)合細(xì)胞結(jié)構(gòu)的制備

圖1d展示了通過(guò)噴嘴擠出至旋轉(zhuǎn)收集器實(shí)現(xiàn)CS73多孔生物墨水各向異性結(jié)構(gòu)構(gòu)建的方法。圖5a、b顯示在不同氣壓（30–45 kPa）與收集器轉(zhuǎn)速（25–38 mm/s）下的擠出效果。在氣壓34 kPa、轉(zhuǎn)速31 mm/s條件下可獲得均勻、連續(xù)且取向良好的各向異性結(jié)構(gòu)（圖5c）?？紫稁缀谓Y(jié)構(gòu)分析表明，經(jīng)拉伸后的結(jié)構(gòu)各向異性增加約兩倍，孔隙率無(wú)明顯變化（圖S11、S12）。

圖5d–f為三組細(xì)胞構(gòu)建體的SEM圖像：對(duì)照組Con為傳統(tǒng)生物打印構(gòu)建物（CS10不可打印），Exp1為常規(guī)打印CS73構(gòu)建物，Exp2為拉伸構(gòu)建物。Exp2展示出顯著的纖維排列方向性，Exp1與Con則為各向同性結(jié)構(gòu)。圖5g和圖S14顯示，Exp1與Exp2中膠原纖維形成速率均高于Con，其中Exp2中的膠原纖維沿拉伸方向高度排列。

圖5h與圖S15顯示拉伸力學(xué)性能，Exp2楊氏模量（15.4 ± 0.9 kPa）高于Exp1（12.7 ± 1.7 kPa），增強(qiáng)效果歸因于拉伸膠原纖維的增強(qiáng)作用。Con構(gòu)建物模量最高（20.4 ± 0.8 kPa），因其膠原含量更高（5 wt.%）且無(wú)孔結(jié)構(gòu)。10–15 kPa的基底硬度已被證實(shí)可通過(guò)整合素和RhoA/ROCK通路促進(jìn)hASC向肌細(xì)胞分化。圖S16顯示Exp2在膠原酶（50 U/mL）處理1–24 h過(guò)程中，6 h起孔壁出現(xiàn)明顯降解，但整體各向異性結(jié)構(gòu)在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

綜上，拉伸過(guò)程顯著影響CS73構(gòu)建物中膠原纖維的排列、孔隙結(jié)構(gòu)的各向異性及整體力學(xué)性能。圖5i示意其通過(guò)力學(xué)刺激、膠原纖維取向及結(jié)構(gòu)各向異性協(xié)同作用，激活機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路，提升hASC的成肌分化潛力，適用于肌肉組織再生。

圖5 泡沫拉伸工藝的優(yōu)化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較以及拉伸泡沫中的肌肉生成誘導(dǎo)。針對(duì) a) 氣壓（n = 20）和 b) 旋轉(zhuǎn)速度（n = 20）的支柱直徑分析，用于優(yōu)化拉伸工藝。c) 拉伸和未拉伸泡沫支柱的光學(xué)圖像。d) 傳統(tǒng)膠原蛋白生物結(jié)構(gòu) (Con)、e) 未拉伸的泡沫生物結(jié)構(gòu) (Exp1) 和 f) 拉伸泡沫生物結(jié)構(gòu) (Exp2) 的膠原蛋白制造示意圖、光學(xué)/SEM 圖像和 3D 共聚焦顯微鏡圖像。g) 膠原蛋白原纖維的取向因子 (n = 3) 和 h) Con、Exp1 和 Exp2 的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線。i) Exp2 中誘導(dǎo)肌肉生成的示意圖。所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示（NS = 統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和*** p < 0.001，使用帶有ANOVA和Tukey的HSD事后檢驗(yàn)的SPSS軟件進(jìn)行分析）

（6）體外分析

圖6a,b顯示三組構(gòu)建物細(xì)胞活率均＞90%。圖6c,d表明，PIEZO-1與vinculin表達(dá)：Con＜Exp1＜Exp2，提示Exp2機(jī)械感應(yīng)增強(qiáng)。圖6e中，Exp2組SACs、FAK-PI3K-AKT、RhoA/ROCK、Wnt/β-catenin、MAPK和YAP/TAZ通路相關(guān)基因顯著上調(diào)。圖6f顯示Exp2中F-actin形成與排列最明顯。圖6g顯示Exp2組MHC表達(dá)和對(duì)齊程度高于Con與Exp1，圖6h定量分析證實(shí)Exp2具有更高的MHC陽(yáng)性面積、融合指數(shù)和成熟指數(shù)，圖6i進(jìn)一步驗(yàn)證MHC和α-actinin蛋白表達(dá)最高。圖6j表明Exp2組Pax7在第14天上調(diào)，Myog、Myod1和Myh2在后期持續(xù)升高，肌源分化與成熟水平最強(qiáng)。結(jié)果表明，Exp2通過(guò)結(jié)構(gòu)對(duì)齊與機(jī)械刺激促進(jìn)hASC成肌分化和肌肉再生。

圖6 評(píng)估生物結(jié)構(gòu)中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌肉生成。 a) Con、Exp1 和 Exp2 生物結(jié)構(gòu)的活/死實(shí)驗(yàn)、DAPI、PIEZO-1、紐結(jié)蛋白和鬼筆環(huán)肽的熒光圖像。b) 第 1 天的初始細(xì)胞活力（n = 4）。分別在第 1 天和第 3 天對(duì) c) PIEZO-1+（n = 4）和 d) 紐結(jié)蛋白+（n = 4）區(qū)域進(jìn)行定量分析。e) 第 3 天（n = 4）的相對(duì)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)。f) 對(duì)第 7 天（n = 4）鬼筆環(huán)肽+區(qū)域（n = 4）進(jìn)行定量分析并計(jì)算取向因子。 g) 第 28 天的 DAPI/MHC 免疫熒光圖像。h) 定向因子（n = 3）、MHC+ 區(qū)域（n = 4）和融合/成熟指數(shù)（n = 4）的定量分析。i) 第 28 天從載細(xì)胞構(gòu)建體中提取的 β-肌動(dòng)蛋白、MHC 和 α-輔肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)印跡。j) 第 14 天和第 28 天的相對(duì)肌生成相關(guān)基因表達(dá)以及第 28 天瓊脂糖凝膠電泳上的 RT-PCR 產(chǎn)物（n = 4）。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD（NS = 統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和 *** p < 0.001，使用 SPSS 軟件通過(guò)方差分析和 Tukey 的 HSD 事后檢驗(yàn)進(jìn)行分析）

（7）體內(nèi)骨骼肌再生的評(píng)估

圖7a,b顯示Con、Exp1與Exp2構(gòu)建物成功植入VML缺損模型，4周后與sham和空白缺損組對(duì)比評(píng)估修復(fù)效果。圖7c顯示各實(shí)驗(yàn)組肌肉重量接近sham。圖7d,e中，Exp2在握力與懸掛測(cè)試中表現(xiàn)優(yōu)于其他組。圖7f為HE與Masson染色結(jié)果，Exp1與Exp2組肌纖維直徑接近sham，Con與缺損組顯著偏?。▓D7g）。圖7h顯示，Exp2組纖維化面積與sham相當(dāng)，Con與Exp1組纖維化明顯增加，提示Exp2組織整合效果最佳。

圖7 肌肉再生示意圖和植入后分析。a）植入過(guò)程示意圖。b）植入后第 0 天和第 4 周的光學(xué)圖像。c）TA 肌肉重量（n = 5），d）握力（n = 5），和 e）懸掛測(cè)試（n = 5）。f）蘇木精和伊紅 (H&E) 和 Masson 三色（MT 染色圖像和測(cè)量 g）肌纖維直徑 (n = 20) 和 (h) 纖維化區(qū)域 (n = 5)。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD（NS = 統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和 *** p < 0.001，使用 SPSS 軟件通過(guò)方差分析和 Tukey 的 HSD 事后檢驗(yàn)進(jìn)行分析）

圖8a–d免疫染色結(jié)果顯示，Exp2組肌肉再生水平與sham接近，優(yōu)于Con與Exp1。ASCs成肌分化呈Con＜Exp1＜Exp2遞增趨勢(shì)。CD31標(biāo)記的血管分析表明，Exp2組血管面積顯著小于其他組，提示血管已進(jìn)入成熟重塑階段。圖8e GSEA分析顯示，Exp2在骨骼肌再生與氧化磷酸化（OXPHOS）相關(guān)基因集中的富集程度（NES）高于Con與Exp1，與sham接近。圖8f富集曲線顯示：肌肉再生相關(guān)基因在sham與Exp2中趨向下調(diào)，在Con與Exp1中上調(diào)；OXPHOS相關(guān)基因則相反，sham與Exp2中上調(diào)，Con與Exp1中下調(diào)。綜上，Exp2構(gòu)建物在促進(jìn)肌肉再生、血管成熟及功能恢復(fù)方面表現(xiàn)最佳（圖7d,e），其基因表達(dá)譜與生理狀態(tài)更接近，修復(fù)效果優(yōu)于Con與Exp1。

圖8 肌肉再生的免疫組織化學(xué)分析，以及關(guān)鍵基因集的基因集富集分析 (GSEA)。a) DAPI/MHC/MRPL11/CD31 的免疫化學(xué)染色圖像和 b) MHC 陽(yáng)性區(qū)域 (n = 3)、c) MRPL11 陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)于 MHC 陽(yáng)性細(xì)胞 (n = 3) 和 d) 血管面積 (n = 3) 的量化結(jié)果。GSEA 包括 (e) 顯示富集基因集的氣泡圖和 f) GSEA 中確定的關(guān)鍵基因集的富集圖，顯示排序基因列表中的運(yùn)行富集得分。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD（NS = 統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和 *** p < 0.001，使用 SPSS 軟件進(jìn)行方差分析和 Tukey 的 HSD 事后檢驗(yàn)）

圖9a–c免疫染色顯示，缺損組和Con組中M1（MHC II?）和M2（CD206?）巨噬細(xì)胞水平較高，Exp1與Exp2組炎癥反應(yīng)較弱，接近sham。結(jié)果表明，膠原-SF復(fù)合泡沫具有良好體內(nèi)生物相容性，適用于安全植入。

圖9 免疫應(yīng)答分析。a) b) MHC II（M1 巨噬細(xì)胞）（n = 3）和 c) CD206（M2 巨噬細(xì)胞）（n = 3）的免疫化學(xué)染色及陽(yáng)性區(qū)域定量結(jié)果。比例尺 20 μm。所有數(shù)據(jù)均以平均值 ± SD 表示（NS = 統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，使用 SPSS 軟件進(jìn)行方差分析和 Tukey's HSD 事后檢驗(yàn)）