三亚老牛影院在线观看_无码av永久免费专区男男_无套中出丰满人妻无码_国产成久热这里只有精品视频6_欧美人妻色网视频_天天躁夜夜躁狠狠躁2021牛牛_linode日本成熟iphone69医生_国产亚洲人成网站在线观看4_国产乱伦精品一区二区_免费的一级片网站

針對上述問題，中國科學院大學肖海華研究員、中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所黃帆研究員和北京大學人民醫(yī)院王建六主任團隊研究開發(fā)了一種合成高密度脂蛋白（sHDL）納米圓盤（sHDL@Pt），用于SPECT/熒光雙模態(tài)成像引導(dǎo)的Pt(IV)前藥遞送。研究設(shè)計并合成了一種Pt(IV)前藥（C2-Pt(IV)-C12），其包含順鉑中間體核心和兩個不對稱脂質(zhì)配體，能夠有效誘導(dǎo)癌細胞DNA損傷并增加雙鏈DNA（dsDNA）片段的產(chǎn)生，進而顯著激活cGAS-STING通路。為了可視化sHDL@Pt的腫瘤積累能力，研究將FDA批準的熒光染料（ICG）和放射性核素（99mTc）加載到納米載體中，分別用于近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像和單光子發(fā)射計算機斷層掃描（SPECT）成像。實驗結(jié)果表明，sHDL@Pt在4T1和GL261-Luc腫瘤小鼠模型中能夠高效積累于腫瘤部位，并且相比順鉑，sHDL@Pt通過引發(fā)強烈的細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）反應(yīng)表現(xiàn)出更強的腫瘤抑制效果。此外，sHDL@Pt與抗PD-1抗體（aPD-1）聯(lián)合使用具有協(xié)同效應(yīng)。該研究強調(diào)了這些納米圓盤在啟動和激活先天免疫以促進腫瘤消融方面的潛力。該研究于2025年8月8日以《Synthetic High-Density Lipoprotein Mimicking Nanodiscs with Pt(IV) Prodrug Enable Tumor Targeting and cGAS-STING Pathway Activation for Chemo-Immunotherapy》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI: 10.1002/adma.202506011）。

圖1 sHDL@Pt納米圓盤的制備及作用機制示意圖。（a）Pt(IV)前藥的結(jié)構(gòu)式及其在體內(nèi)還原為Pt(II)的機制；（b）sHDL@Pt的制備示意圖；（c）通過NIR-II熒光成像和SPECT成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)sHDL@Pt可有效在腫瘤部位積累，誘導(dǎo)嚴重DNA損傷，激活cGAS-STING通路，促進樹突狀細胞成熟和T細胞增殖，觸發(fā)細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng)，抑制腫瘤生長

（1）sHDL@Pt的細胞攝取及在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累

C2-Pt(IV)-C12通過順鉑氧化并與十二烷酸酐和乙酸酐反應(yīng)合成，其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振光譜確認。sHDL@Pt由22A、DMPC和C2-Pt(IV)-C12按1:5:10質(zhì)量比組裝而成，粒徑約10 nm。用熒光染料Cy5.5標記sHDL@Pt形成Cy5.5/sHDL@Pt（圖2A）。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察到，GL261細胞與Cy5.5/sHDL@Pt孵育時，隨孵育時間延長，細胞內(nèi)熒光強度增加（圖2B），孵育7小時的細胞熒光強度比1小時增加了2.6倍（圖2C、D）。電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）檢測顯示，GL261細胞內(nèi)sHDL@Pt含量隨孵育時間延長而增加（圖2E），且sHDL@Pt的攝取量比順鉑高約一個數(shù)量級。ICP-MS實驗還表明，sHDL@Pt在GL261細胞的細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均有富集，而順鉑主要富集在細胞核中，分別有3.8%的順鉑和8.1%的sHDL@Pt富集在線粒體中（圖2F、G）。這表明sHDL@Pt能夠進入癌細胞并主要定位于細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

圖2 sHDL@Pt的細胞攝取及在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累。（a）sHDL@Pt處理癌細胞的實驗示意圖；（b）GL261細胞與Cy5.5/sHDL@Pt共孵育1、4、7小時后的代表性共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像，細胞核用DAPI染色（藍色），細胞骨架用肌動蛋白染色（綠色），Cy5.5為紅色，圖中為三張圖像的疊加（實驗獨立重復(fù)3次，結(jié)果相似），比例尺為10 μm；（c）用流式細胞術(shù)（FCM）評估GL261細胞攝取Cy5.5/sHDL@Pt在1、4、7小時后的結(jié)果（n = 3）；（d）（c）中熒光強度的定量結(jié)果；（e）GL261細胞分別用20 μM Pt的順鉑和sHDL@Pt處理0.5、1、3小時后細胞內(nèi)Pt含量（n = 3）；（f）用ICP-MS檢測GL261細胞與2 μM的順鉑和sHDL@Pt共孵育2小時后Pt在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核和線粒體中的分布（n = 4）；（g）Pt在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核和線粒體中的分布比例。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，（d）用單因素方差分析（ANOVA）結(jié)合Bonferroni多重比較后檢驗分析數(shù)據(jù)，（e）和（f）用雙因素方差分析結(jié)合Bonferroni多重比較后檢驗分析數(shù)據(jù)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001

（2）sHDL@Pt有效誘導(dǎo)癌細胞死亡

MTT實驗結(jié)果表明，sHDL@Pt對GL261、MDA-MB-231、Ishikawa和4T1等多種癌細胞系的細胞毒性高于順鉑（圖3A）。sHDL@Pt的IC50值分別為GL261的1.3 ± 0.1 μM、MDA-MB-231的2.8 ± 0.5 μM、Ishikawa的2.0 ± 0.6 μM和4T1的0.8 ± 0.07 μM（圖3B）。MDA-MB-231細胞系中順鉑與sHDL@Pt的IC50比值為22，顯示sHDL@Pt對三陰性乳腺癌的抗腫瘤活性顯著高于順鉑。sHDL@Pt誘導(dǎo)的凋亡率是順鉑的4.3倍（圖3C、D）。3D細胞球體的活/死染色結(jié)果顯示，順鉑處理的細胞在3D細胞球體外圍顯示強綠色熒光（活細胞標志）和弱紅色熒光（死細胞標志），而sHDL@Pt處理的細胞在3D細胞球體內(nèi)部顯示強紅色熒光和極少量綠色熒光，表明sHDL@Pt的細胞毒性更高且能穿透3D腫瘤細胞結(jié)構(gòu)（圖3E）?？寺⌒纬蓪嶒烇@示，sHDL@Pt處理的GL261細胞克隆數(shù)量顯著減少，而順鉑處理的細胞克隆數(shù)量較多（圖3F）。這些結(jié)果表明sHDL@Pt能顯著抑制腫瘤細胞生長（圖3G）。

圖3 sHDL@Pt有效誘導(dǎo)癌細胞死亡。（a）藥物劑量反應(yīng)曲線（n = 3）：GL261、MDA-MB-231、ISK和4T1細胞分別用順鉑和sHDL@Pt處理；（b）順鉑和sHDL@Pt在GL261、MDA-MB-231、ISK和4T1癌細胞中的IC50值；（c）GL261細胞用順鉑和sHDL@Pt（5 μM，24 h）處理后的凋亡檢測（n = 3）；（d）GL261細胞用順鉑和sHDL@Pt（5 μM，24 h）處理后的凋亡比例統(tǒng)計（n = 3）；（e）3D細胞球體用順鉑和sHDL@Pt（10 μM，24 h）處理后的代表性CLSM圖像（實驗獨立重復(fù)3次，結(jié)果相似）；（f）sHDL@Pt（0.2 μM）有效抑制GL261細胞的克隆形成能力，結(jié)晶紫染色顯示克隆形成能力（實驗獨立重復(fù)3次，結(jié)果相似）；（g）sHDL@Pt誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的示意圖。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，（d）用單因素方差分析（ANOVA）結(jié)合Bonferroni多重比較后檢驗分析數(shù)據(jù)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001

圖4 sHDL@Pt激活cGAS-STING通路。（a）4T1細胞用順鉑和sHDL@Pt（2 μM，24 h）處理后γ-H2AX的代表性CLSM圖像；（b）~（d）分別為對照組、順鉑組和sHDL@Pt組沿（a）中白虛線的熒光共定位分析；（e）用流式細胞術(shù)（FCM）分析4T1細胞用順鉑和sHDL@Pt（2 μM，24 h）處理后γ-H2AX的表達水平；（f）（e）中γ-H2AX表達水平的定量分析；（g）4T1細胞用順鉑和sHDL@Pt（1 μM，24 h）處理后P-TBK1、P-IRF3和P-STING表達的Western blot分析。實驗獨立重復(fù)3次，結(jié)果相似。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，（f）用單因素方差分析（ANOVA）結(jié)合Bonferroni多重比較后檢驗分析數(shù)據(jù)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001

（4）MDA-MB-231細胞用順鉑和sHDL@Pt處理后的轉(zhuǎn)錄組分析

RNA測序分析顯示，MDA-MB-231細胞經(jīng)PBS、順鉑和sHDL@Pt處理后共鑒定出11394個基因，PCA和維恩圖顯示各組間轉(zhuǎn)錄組存在顯著差異（圖5A、B）。與對照組相比，sHDL@Pt處理組有10133個差異表達基因，其中4960個上調(diào)，5173個下調(diào)（圖5C）。與順鉑處理組相比，sHDL@Pt處理組有6789個差異表達基因，其中3390個上調(diào)，3399個下調(diào)（圖5D）。GO富集分析顯示，sHDL@Pt處理的MDA-MB-231細胞中，與細胞對DNA損傷應(yīng)答、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制、DNA重組及同源重組修復(fù)雙鏈斷裂相關(guān)的基因表達受影響（圖5E）。KEGG和GSEA分析表明，sHDL@Pt顯著影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)處理、DNA復(fù)制、同源重組、錯配修復(fù)及FoxO信號通路、PD-L1表達和PD-1檢查點通路等免疫和炎癥相關(guān)信號通路（圖5F、G；圖S9，支持信息）。與對照組相比，sHDL@Pt處理組中與cGAS-STING通路直接相關(guān)的基因（TBK1、CGAS、IRF3和H2AX）表達上調(diào)（圖5H）。這些結(jié)果表明，sHDL@Pt通過誘導(dǎo)DNA損傷、改變蛋白磷酸化和調(diào)節(jié)通路相關(guān)基因的表達來調(diào)控cGAS-STING通路，可能增強免疫刺激因子的表達和釋放，重塑免疫抑制微環(huán)境（圖5I）。

圖5 MDA-MB-231細胞用順鉑和sHDL@Pt處理后的轉(zhuǎn)錄組分析。（a）MDA-MB-231細胞用對照、順鉑和sHDL@Pt處理后的基因表達主成分分析（PCA）得分圖；（b）鑒定的差異表達基因的維恩圖；（c）~（d）分別為MDA-MB-231細胞用sHDL@Pt與對照組、sHDL@Pt與順鉑組處理后的火山圖；（e）MDA-MB-231細胞用sHDL@Pt與對照組處理后的基因本體（GO）生物過程分類；（f）MDA-MB-231細胞用sHDL@Pt與對照組處理后的京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析；（g）基因集富集分析（GSEA）顯示MDA-MB-231細胞用sHDL@Pt與對照組處理后同源重組通路的正富集（數(shù)據(jù)用GSEA軟件包分析，未作修改）；（h）MDA-MB-231細胞用sHDL@Pt與對照組處理后的基因表達熱圖；（i）MDA-MB-231細胞用sHDL@Pt處理后的潛在機制圖。n = 3實驗重復(fù)

（5）通過多模態(tài)成像評估sHDL@Pt在體內(nèi)靶向腫瘤區(qū)域的能力

99mTc/sHDL@Pt通過DSPE-PEG2000-DTPA制備并用Na99mTcO4標記（圖6A），其在小鼠體內(nèi)的α相半衰期為0.72 ± 0.23 h，比Na99mTcO4長。SPECT成像顯示99mTc/sHDL@Pt靜脈注射后能快速在腫瘤部位積累，并在給藥后4小時達到最高放射性信號（圖6B），顯示出更強的腫瘤靶向能力和更長的保留時間。ICG/sHDL@Pt通過FDA批準的NIR-II熒光染料ICG標記（圖6C），其在小鼠體內(nèi)的循環(huán)半衰期在α相為0.43 ± 0.08小時，β相為5.06 ± 4.40小時。NIR-II熒光成像顯示ICG/sHDL@Pt靜脈注射后能快速在腫瘤部位積累，在給藥后4小時達到最高熒光強度，且在腫瘤部位的保留時間超過96小時（圖6D，圖6E）。給藥96小時后，收集小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和腫瘤進行成像（圖6F），結(jié)果顯示腫瘤部位的熒光信號分別是心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟的28.4、3.9、18.0、9.3和4.0倍（圖6G）。ICG/sHDL@Pt被靜脈注射到膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）小鼠模型中，72小時后收集大腦和主要器官進行NIR-II熒光成像（圖6H）。結(jié)果顯示ICG/sHDL@Pt能快速穿過血腦屏障并到達腦腫瘤部位，且在腫瘤部位的保留時間超過96小時。給藥96小時后，收集小鼠的心肝脾肺腎和大腦進行成像，結(jié)果顯示熒光信號主要富集在腦腫瘤部位，其他腦區(qū)熒光較少，腫瘤部位的熒光信號分別是心臟、脾臟、肺和腎臟的6.3、3.6、3.9和1.5倍。這些結(jié)果表明sHDL@Pt能有效靶向并積累于惡性腦腫瘤。

（6）sHDL@Pt在多種癌癥模型中抑制腫瘤生長

在TNBC模型中，4T1腫瘤小鼠用順鉑和sHDL@Pt（Pt劑量1.0 mg/kg）處理，PBS作對照（圖7A）。順鉑組TGI為57%，sHDL@Pt組TGI達76%，且sHDL@Pt組小鼠全部存活，而對照組和順鉑組小鼠均在36天內(nèi)死亡（圖7B、C）。在免疫“冷”TNBC模型中，評估了aPD-1及其與sHDL@Pt聯(lián)合（sHDL@Pt + aPD-1）的抗腫瘤效果（圖7D）。aPD-1的TGI為57%，而sHDL@Pt + aPD-1的TGI達88%（圖7E），且其處理的小鼠中位生存期為42天，比單獨aPD-1處理的小鼠（36天）更長（圖7F）。第26天測量腫瘤中免疫細胞反應(yīng)，sHDL@Pt + aPD-1處理的小鼠中成熟DCs（CD11c+ CD80+ CD86+）比例約48%，顯著高于對照組（約28%）和單獨aPD-1處理的小鼠（約38%）；CD8+ T細胞數(shù)量分別是對照組和單獨aPD-1處理小鼠的1.8倍和1.2倍；Foxp3水平顯著低于對照組或單獨aPD-1處理的小鼠；MDSCs頻率最低（圖7G），表明sHDL@Pt + aPD-1能刺激系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，有效抑制腫瘤生長。在GL261-luc腫瘤小鼠模型中，sHDL@Pt能有效抑制腫瘤生長（圖7H–J）。H&E染色顯示，對照組小鼠大腦中腫瘤細胞顯著浸潤，而sHDL@Pt處理組小鼠大腦中僅檢測到少量腫瘤細胞，且腫瘤組織中細胞損傷嚴重（圖7K）。GL261-luc腫瘤小鼠模型的長期生存評估顯示，對照組小鼠中位生存時間為40天，sHDL@Pt處理組小鼠中位生存時間顯著延長至60天（圖7L）。

圖7 sHDL@Pt在多種癌癥模型中抑制腫瘤生長。（a）三陰性乳腺癌（TNBC）治療時間表示意圖；（b）TNBC腫瘤生長抑制曲線比較；（c）TNBC用對照、順鉑和sHDL@Pt處理后的生存曲線（n = 5）；（d）sHDL@Pt與抗PD-1（aPD-1）療法在TNBC小鼠模型中協(xié)同作用示意圖；（e）TNBC用sHDL@Pt和aPD-1協(xié)同治療后的腫瘤生長抑制曲線比較；（f）TNBC用sHDL@Pt和aPD-1協(xié)同治療后的生存曲線；（g）腫瘤組織中CD45+ T細胞中Gr-1+ CD11b+細胞的百分比（n = 5）；（h）膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）治療時間表示意圖；（i）原位GBM模型用順鉑和sHDL@Pt處理后的體內(nèi)生物發(fā)光成像（n = 5）；（j）通過分析生物發(fā)光信號的歸一化強度評估的平均腫瘤生長動力學（n = 5）；（k）用順鉑和sHDL@Pt處理后的全腦切片的代表性H&E染色；（l）GBM用對照、順鉑和sHDL@Pt處理后的生存曲線（n = 5）。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，（g）用單因素方差分析（ANOVA）結(jié)合Bonferroni多重比較后檢驗分析數(shù)據(jù)，（b、e、j）用雙因素方差分析結(jié)合Bonferroni多重比較后檢驗分析數(shù)據(jù)，（c、f、l）用對數(shù)秩Mantel-Cox檢驗分析數(shù)據(jù)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001