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針對(duì)上述問題，中科院動(dòng)物所的顧奇團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種可3D打印的物理-化學(xué)異質(zhì)微凝膠-水凝膠雜化材料（GMMHM）。該材料兼具高力學(xué)強(qiáng)度（抗生理剪切力）和柔軟表面（促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附、血管新生），并具剪切稀化及自愈合特性，可同時(shí)用于嵌入式和擠出式生物打印。利用GMMHM，作者構(gòu)建了含1億細(xì)胞/mL的厚血管化肝組織，內(nèi)嵌可手術(shù)吻合的宏觀血管通道。將其植入85%肝切除的SD大鼠后，移植物在術(shù)中即可與宿主血管直接吻合，實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)血流灌注并快速恢復(fù)肝功能，顯著延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間，為急性肝衰竭等疾病的可移植治療提供了新的技術(shù)平臺(tái)。該文章于2025年4月4日以《A Microgel–Hydrogel Hybrid for Functional Compensation and Mechanical Stability in 3D Printed Cell-Dense Vascularized Liver Tissue》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202413940）。

圖1 3D生物打印微凝膠-水凝膠混合物用于可植入血管化肝組織的示意圖

（1）微凝膠-水凝膠雜化材料的設(shè)計(jì)

為了實(shí)現(xiàn)水凝膠封裝細(xì)胞的治療應(yīng)用并促進(jìn)其與宿主血管的直接吻合，開發(fā)了一種具有“雙重”軟硬特性的微凝膠-水凝膠混合物。GelMA微凝膠、HA-MA前體和Matrigel混合形成了GMMHM混合物，經(jīng)過紫外線輻射和37°C培養(yǎng)，利用化學(xué)交聯(lián)和物理纏繞的協(xié)同作用（圖2A）。HA-MA大分子作為“繩索”交聯(lián)微凝膠以穩(wěn)定整體結(jié)構(gòu)。GMMHM的微環(huán)境通過內(nèi)部密集交聯(lián)和外部松散交聯(lián)增強(qiáng)了彈性特性，并支持細(xì)胞活動(dòng)。GelMA具有熱敏性，微凝膠在37°C時(shí)會(huì)失去結(jié)構(gòu)完整性。GMMHM水凝膠在紫外線輻射后形成，并在37°C下穩(wěn)定。通過不同的GMM替代度（45%、60%、75%）制備了三組微凝膠，且較低的替代度導(dǎo)致水凝膠結(jié)構(gòu)的損壞。為增強(qiáng)共價(jià)交聯(lián)，將HA-MA前體添加至GMM中，75%替代度的GMM在37°C下穩(wěn)定。交聯(lián)后的GelMA微凝膠的彈性模量通過原子力顯微鏡測(cè)試，結(jié)果表明不同微凝膠內(nèi)部和之間的空間異質(zhì)性（圖S2B）。通過調(diào)節(jié)HA-MA濃度和GMM濃度，水凝膠的機(jī)械性能顯著變化，0.04% HA-MA與2.5% GMM組合可顯著增加有效楊氏模量（Eff.Y.mod）（圖2B，C）。進(jìn)一步優(yōu)化通過加入Matrigel的GMMHM水凝膠，增強(qiáng)穩(wěn)定性和生物相容性，其機(jī)械性質(zhì)類似于GMMHM（圖2F，G）。力學(xué)性能測(cè)試顯示GMMHM水凝膠的韌性和壓縮性優(yōu)于GMM（圖S2C，F(xiàn)）。水凝膠的微孔結(jié)構(gòu)對(duì)機(jī)械性能和細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，冷凍掃描電鏡（cryo-SEM）顯示GMMHM微結(jié)構(gòu)具有顯著異質(zhì)性，內(nèi)部結(jié)構(gòu)密集交聯(lián)，外部松散交聯(lián)（圖2H，I，J）。GMMHM的微孔結(jié)構(gòu)顯著高于均勻水凝膠，支持了細(xì)胞附著和質(zhì)量運(yùn)輸（圖2K）。

圖2（A）通過改變UV與37 °C處理順序構(gòu)建GMMHM與GMMHM?雜化水凝膠的示意圖；（B-H）依次為不同HA-MA、GMM、GelMA濃度及體系對(duì)比的彈性模量或儲(chǔ)能模量結(jié)果；（I-K）展示GMM、GMMH、GMMHM、GMMHM?及GMHM水凝膠的交聯(lián)結(jié)構(gòu)示意圖、冷凍SEM圖像（黃色示微凝膠，標(biāo)尺100 μm）及其孔面積占比與分布差異

（2）通過嵌入式打印制造具有大血管的直接血管吻合術(shù)

為實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞和功能補(bǔ)償，工程化厚組織需要具有層次化大血管，能夠與宿主血管吻合，并能承受灌注帶來的機(jī)械剪切應(yīng)力。GMMHM水凝膠混合物中的微凝膠為嵌入式3D打印提供足夠支持，作為模板形成所需的血管通道。通過平行板幾何和振蕩剪切流變學(xué)測(cè)試，評(píng)估了該混合物的流變特性（圖3A）。壓實(shí)后，混合物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的剪切稀化行為（圖3B，C）。在5%和100%應(yīng)變下，混合物展示了應(yīng)變屈服和自愈合行為（圖3D）。當(dāng)溫度低于32°C時(shí)，混合物在低頻下表現(xiàn)為固體反應(yīng)（圖3E）。頻率增加至13 Hz時(shí)，混合物呈現(xiàn)賓漢流體行為，損失模量超過儲(chǔ)能模量（圖3F）。紫外線照射和37°C培養(yǎng)后，混合物交聯(lián)以保持結(jié)構(gòu)完整性，墨水的儲(chǔ)能模量降至5 Pa，易于去除（圖3F）。因此，GMMHM混合物可作為支持水凝膠混合物，用于生物打印宏觀血管網(wǎng)絡(luò)并在交聯(lián)后穩(wěn)定通道（圖3G）。GMMHM能作為擠出矩陣進(jìn)行生物打印。使用250 μm和400 μm噴嘴打印嵌入式3D螺旋通道，觀察到賓漢流體行為（圖3H–J）。噴嘴直徑直接影響墨水直徑，從而形成螺旋結(jié)構(gòu)（圖3M）。不同打印速度影響通道直徑，例如，250 μm噴嘴可用于打印不同直徑的通道（253和750 μm）（圖3K,L）。為了制造層次化大血管，打印了1-2-4通道模型（圖3N,O）和雙螺旋通道模型（圖3P–R；）。去除墨水后，綠色染料溶液被灌注到打印的交聯(lián)混合物通道中。

圖3（A）嵌入式擠出打印構(gòu)建GMMHM宏觀血管示意圖；（B）振蕩流變、黏度、時(shí)間-溫度掃描及UV/37 ℃處理后的儲(chǔ)能模量變化；（C）不同噴嘴直徑與打印速度對(duì)螺旋管腔直徑的影響；（D）一分二、四分叉及雙螺旋通道的光學(xué)圖像與示意圖；（E）GMMHM打印血管與宿主頸總動(dòng)脈-頸靜脈直接吻合實(shí)現(xiàn)即時(shí)血流的示意圖及實(shí)拍

（3）3D生物打印結(jié)構(gòu)中的初步血管生成和血管生成

為了模擬多尺度血管網(wǎng)絡(luò)，GMMHM水凝膠混合物中微凝膠提供支持，有助于內(nèi)皮細(xì)胞自組裝和血管形成。通過封裝RFP-HUVECs和HFF聚集體于GMMH和GMMHM水凝膠中，研究了血管形態(tài)發(fā)生與血管生成。在GMMHM中，血管芽生長(zhǎng)和分支較為明顯，GMMHM+加成長(zhǎng)因子后，形成了更復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)（圖4B）。與此相比，GMMH水凝膠網(wǎng)絡(luò)較少，細(xì)胞聚集較多。使用MMP抑制劑GM6001處理后，GMMHM+中的血管生成顯著減少，表明血管生成依賴于水凝膠結(jié)構(gòu)的降解（圖4D,E）。掃描電子顯微鏡（SEM）結(jié)果顯示，GMMHM+形成的毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)較長(zhǎng)且較多（圖4C）。進(jìn)一步評(píng)估GMMHM+的血管生成能力時(shí)，RFP-HUVECs在GMMHM+表面形成了致密單層，顯示出良好的細(xì)胞間互作（圖4F,H）。通過直接注射RFP-HUVECs，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞層在管腔表面形成，并通過微通道滲透FITC標(biāo)記的葡聚糖，證明了內(nèi)皮屏障功能。剪切應(yīng)力作用下，血管芽從內(nèi)腔擴(kuò)展至GMMHM+水凝膠中，表現(xiàn)出較強(qiáng)的血管生成能力，遠(yuǎn)超GMHM+水凝膠（圖4K）。血管生成后，綠色熒光微珠通過新形成的腔道進(jìn)入水凝膠，證明了血管生成支持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸入（圖4L）。3D共聚焦顯微鏡圖像顯示，內(nèi)皮細(xì)胞附著并向水凝膠擴(kuò)展（圖4M）。以上結(jié)果表明，GMMHM+水凝膠通過微孔結(jié)構(gòu)和異質(zhì)剛度促進(jìn)了血管網(wǎng)絡(luò)的形成，包括血管生成和血管生成過程（圖4I,J）。

圖4（A）GMMHM+水凝膠介導(dǎo)的血管新生、內(nèi)皮化與出芽模式示意圖；（B-D）3 d共培養(yǎng)RFP-HUVEC/HFF在多種凝膠中的血管生成3D重構(gòu)、SEM及管長(zhǎng)/分支點(diǎn)定量；（E-G）HUVEC二維黏附、覆蓋率隨時(shí)間變化及CD31免疫染色；（H-K）微通道內(nèi)HUVEC出芽、FITC微球示蹤灌注及5 d厚組織內(nèi)3D血管網(wǎng)絡(luò)

（4）支持MSC和實(shí)質(zhì)細(xì)胞活性

為了評(píng)估異質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞活力的影響，不同類型的細(xì)胞分別被包裹在GMMHM和GMMHM?水凝膠混合物中。HUVEC-HFF聚集體在GMMHM中的生物相容性顯著優(yōu)于GMM和GMMH（水凝膠），細(xì)胞在微凝膠表面展開展現(xiàn)了優(yōu)良的擴(kuò)展性和分布（圖5B、E）。GFP-MSCs在微凝膠表面的共聚焦顯微鏡圖像顯示，MSC細(xì)胞展布廣泛，呈現(xiàn)典型的成纖維樣形態(tài)，且GMMHM的異質(zhì)結(jié)構(gòu)使細(xì)胞比在均勻結(jié)構(gòu)的GMMHM?中分布更廣（圖5C、D、F）。這些結(jié)果表明，微凝膠的添加增強(qiáng)了細(xì)胞活性，可能與其較高的剛度和微孔結(jié)構(gòu)有關(guān)（圖5A）。為了驗(yàn)證GMMHM在支持原代肝細(xì)胞和ESC分化心肌細(xì)胞功能上的潛力，分別使用了原代人肝細(xì)胞（PHHs）和ESC分化心肌細(xì)胞作為模型。PHHs在GMMHM中培養(yǎng)后，維持了均一的活細(xì)胞群體（圖5G）。與GMMHM相比，PHHs在GMMHM中的代謝活性顯著提高，表現(xiàn)出更高的I期酶（CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4）表達(dá)，顯示了潛在的肝組織構(gòu)建能力（圖5H）。此外，經(jīng)過20天培養(yǎng)后，分化的心肌細(xì)胞在GMMHM中表現(xiàn)出明顯的自發(fā)收縮，表明GMMHM能有效支持不同組織模型的構(gòu)建。這些結(jié)果表明，GMMHM水凝膠可以作為多種組織模型的支架。

圖5（A）GMMHM與GMMHM?內(nèi)細(xì)胞活性示意圖；（B）HUVEC/HFF共培養(yǎng)24 h活/死染色；（C-D）GFP-MSC在兩種凝膠中第1、3、5天形態(tài)及分支面積定量；（E）GMM、GMMH、GMMHM中HUVEC/HFF 24 h存活率；（F-G）PHH活/死染色及CYP1A1、1A2、3A4代謝活性對(duì)比

（5）優(yōu)化三維空間構(gòu)建組織模型的HCD方法

在模擬生理組織的水凝膠中，細(xì)胞密度是工程化組織成熟和功能的關(guān)鍵因素之一。3D生物打印的最大細(xì)胞密度為10M/mL，遠(yuǎn)低于體內(nèi)組織的細(xì)胞密度。以細(xì)胞聚集體為基礎(chǔ)的工程組織可能存在壞死區(qū)域，且更容易受到血管網(wǎng)絡(luò)密度的影響。通過平衡水凝膠混合物的剛度、組分比例與組織中的高細(xì)胞密度（HCD）可實(shí)現(xiàn)大血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建（圖6A）。肝臟組織（圖6B）含有約100M/mL的肝細(xì)胞，具有密集的細(xì)胞微環(huán)境和血管（圖6C）。肝臟組織的彈性模量（Eff.Y.mod）分布呈現(xiàn)異質(zhì)性（圖6J）。隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，組織的體積明顯增加（圖6D）。HepG2和原代豬肝細(xì)胞（PPHs）的體積分別為350 μL和550 μL，約構(gòu)成1億個(gè)細(xì)胞（圖S9C）。當(dāng)細(xì)胞濃度為50M/mL時(shí)，GMMHM的Eff.Y.mod顯著下降，導(dǎo)致無法進(jìn)行植入（圖6E）。為了優(yōu)化基質(zhì)，1mL肝組織中的水凝膠體積設(shè)定為450 μL，以維持100M/mL的細(xì)胞密度（圖6F）。SEM圖像顯示細(xì)胞被水凝膠混合物包裹，呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)（圖6G-I）。含有0.6% GMM和0.56% HA–MA的水凝膠混合物的Eff.Y.mod與肝臟表面相當(dāng)（圖6K）。該水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性（圖6L），適用于后續(xù)構(gòu)建具有HCD的植入肝臟組織。HepG2細(xì)胞的HCD增加了混合物的剪切模量，而未影響其壓縮模量（圖6M,N），增強(qiáng)了混合物的穩(wěn)定性，以承受血流。所有結(jié)果表明，新設(shè)計(jì)的GMMHM混合物（nGMMHM）適合用于構(gòu)建具有高細(xì)胞密度的組織。

圖6（A）高細(xì)胞密度肝組織構(gòu)建示意圖；（B）小鼠肝組織光學(xué)圖及內(nèi)部SEM（50 μm）；（C）100 M HepG2/PPH分布量化；（D）含/不含100 M PPH的GMMHM彈性模量對(duì)比；（E）不同GMM/HA-MA配比及含/不含HepG2的冷凍-SEM（黃：微凝膠，粉：細(xì)胞，100/20 μm）與SEM（10 μm）；（F）肝組織不同區(qū)域與GMMHM配比的彈性模量、剪切模量、壓縮模量及HepG2存活率比較

（6）細(xì)胞-高密度水凝膠雜化物促進(jìn)肝臟功能的研究

研究表明，高細(xì)胞密度（HCD）在保證細(xì)胞間相互作用和促進(jìn)組織形成方面起著關(guān)鍵作用。除了評(píng)估細(xì)胞存活率外，還對(duì)HepG2和PPHs在混合培養(yǎng)中7天后的肝功能進(jìn)行了評(píng)估。免疫染色和qPCR結(jié)果表明，HepG2基質(zhì)中人類白蛋白（hAlb）和α1-抗胰蛋白酶（AAT）表達(dá)水平較高。此外，肝臟特異性基因（如肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）和非半乳糖蛋白受體1（ASGPR1））的表達(dá)也有所上升，表明肝細(xì)胞功能的成熟（圖7A，B）。ALB和CK18的表達(dá)與細(xì)胞密度顯著相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了HCD的重要性（圖7C，D）。HNF4α的高表達(dá)表明肝細(xì)胞在混合物中的成熟（圖7E）。這些結(jié)果表明，組織中PPH細(xì)胞的密度越高，肝功能越強(qiáng)，表明HCD對(duì)于人工肝組織的構(gòu)建至關(guān)重要。此外，評(píng)估了通過嵌入式生物打印在nGMMHM中構(gòu)建大血管的性能。添加黃原膠（XG）后，GMMH中的3D“+”通道結(jié)構(gòu)和2D“一對(duì)二”通道的保真度有所提高（圖S10C，D）。XG濃度增加導(dǎo)致混合物的粘度增大。添加了0.5 wt% XG的GMMH混合物與1.2 wt% XG的混合物粘度相當(dāng)（圖S10F）。交聯(lián)后的儲(chǔ)能模量未受XG或Matrigel影響。然而，含HepG2和HCD的混合物儲(chǔ)能模量從500 Pa增加到820 Pa。因此，選擇含0.5% XG的nGMMHM配方用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖7（A、B）體外培養(yǎng)7天的不同細(xì)胞密度的PPH肝組織的免疫染色共聚焦熒光圖像（比例尺：50 μm）。（C-E）不同細(xì)胞密度的PPH雜交體中AL B、CK 18和HNF 4β表達(dá)水平的比較

（7）SD大鼠工程化血管化肝的快速功能支持

3D生物打印的器官在體外構(gòu)建為解決器官捐獻(xiàn)不足提供了潛力。為在急性肝衰竭的SD大鼠中提供肝臟功能支持，將生物打印的具有高細(xì)胞密度（HCD）的血管化組織直接與宿主血管進(jìn)行外科吻合（圖8A）。這證明了在體內(nèi)肝功能的補(bǔ)償作用。通過85%的肝切除術(shù)建立急性肝衰竭模型（圖8A，B），結(jié)果顯示，移植含有PPHs的工程肝組織可延長(zhǎng)生存時(shí)間，從2.5小時(shí)增加到12小時(shí)，表明移植的肝組織對(duì)損傷的肝臟提供了功能補(bǔ)償。與HepG2組相比，PPHs組表現(xiàn)出更好的補(bǔ)償效果（圖8E）。血液生化分析顯示，經(jīng)過PPHs治療3小時(shí)后，血清氨水平顯著降低，表明PPHs組對(duì)解毒有直接或間接支持作用（圖8G）。此外，AST、GLB和ALT水平降低，進(jìn)一步證明肝損傷得到改善。工程肝臟在移植后3小時(shí)和10小時(shí)被取出分析（圖8I）。組織中的通道內(nèi)含有紅血球，表面平滑無纖維蛋白沉積，表明通道通暢。與遠(yuǎn)離通道的細(xì)胞相比，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，且ALB的表達(dá)在10小時(shí)時(shí)顯著高于3小時(shí)樣本。此外，移植5天后的100 M/mL HepG2組織也顯示ALB表達(dá)增加，表明工程肝組織具有一定功能。這些結(jié)果表明，工程肝組織有效支持肝臟功能并減輕PH引起的高氨血癥。

圖8（A）血管化肝組織經(jīng)頸總動(dòng)脈-頸靜脈直接吻合植入85%肝切除衰竭大鼠示意圖；（B）手術(shù)造模及切除肝臟照片；（C）六角棱柱移植物內(nèi)紅色通道與綠色熒光微粒示蹤（標(biāo)尺1 mm）；（D）吻合后移植物血流灌注及植入體實(shí)物圖；（E）移植組與對(duì)照組生存曲線、血紅蛋白及血氨、AST、ALT、GLB、A/G、ALB生化指標(biāo)；（F）移植3 h與10 h肝組織HE與ALB染色（標(biāo)尺20×50 μm、63×20 μm）